실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석
Summary
우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 관절염, 유전 요인 및 다른 로드 regimens 영향 chondrocytes 제자리에서 의 취약점을 조사 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.
Abstract
관절 연골의 항상성 주민 세포 (chondrocytes)의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 불행 하 게도, 기계적 외상은 잠재적으로 공동의 돌이킬 수 없는 고장 및 관절염의 발병에 이르는 광범위 한 chondrocyte 죽음을 유도할 수 있다. 또한, chondrocyte 생존 능력의 유지 관리는 최적의 수술 결과 대 한 osteochondral 이식 절차에서 중요 하다. 우리는 응용 프로그램 제어 기계 부하 또는 영향의 후 그대로 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가 하는 방법을 제시. 이 메서드는 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 유전자 조작의 효과 뿐만 아니라 다른 단계에 짧은-장기 연골 변성의 조사 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 원래의 관절 chondrocytes의 취약점입니다. 원고에 소개 하는 프로토콜의 목표 murine 활 액 관절의 관절 표면에 세포 상해/죽음의 공간 범위를 평가입니다. 중요 한 것은,이 메서드는 네이티브 경계 조건 없이 완전히 그대로 연골에 테스트 수 있습니다. 또한, 그것은 vitally 스테인드 관절 chondrocytes의 실시간 시각화 및 제어 정적 및 영향 regimens 로드의 응용 프로그램에 의해 유도 된 세포 상해의 단일 이미지 기반 분석에 대 한 수 있습니다. 우리의 대표적인 결과 건강 한 연골 explants 세포 상해의 공간적 범위에 따라 달라 집니다 민감하게 부하 강도 및 충격 강도 보여줍니다. 우리의 방법은 쉽게 다른 기계적 부하 regimens, 다른 환경 조건이 나 관절 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점에 다른 유전자 조작의 효과 조사 하기 위해 적용할 수 있습니다.
Introduction
관절 연골 (AC)는 베어링 커버와 부드러운 공동 조음을 제공 하는 활 액 관절에서 뼈를 보호 하는 조직 로드. 조직의 항상성 chondrocytes, AC에 있는 유일한 셀 타입의 생존 능력에 따라 달라 집니다. 그러나, 극단적인 세력 (예를 들어, 폭포, 차량 사고 또는 스포츠 부상) 외상 또는 외상 후 관절 불안정성 때문에 연골의 노출 chondrocyte 죽음, 관절 (관절염)의 돌이킬 수 없는 고장에 지도 일으킬 수 있다 1. 또한, osteochondral 손상 된 연골에 로컬 결함을 복구 하는 것을 목표로 하는 절차를 접목, 이식 삽입 관련 된 기계적 외상 chondrocyte 생존 능력을 감소에 수술 결과2에 해로운 효과가 있다.
연골 explant 모델 일반적으로 기계적으로 유도 된 세포 죽음을 관절 chondrocytes의 민감성을 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 모델 일반적으로를 사용 하 여 큰 동물에서 explants 로드 조건, 환경 조건 및 셀 취약점3,,45,6, 에 다른 요인의 효과 공부 7,8,9,10,11,12,13,,1415. 그러나, 네이티브 관절의 큰 크기 때문에 이러한 모델 제거 함으로써 네이티브 경계 조건 타협 그대로 관절의 관절 표면에서 플러그의 일반적으로 필요 합니다. 또한, 그들은 일반적으로 세포 상해를 유도 하기 위해 대형 기계 부하의 응용 프로그램을 필요 합니다. 또는, murine 연골 explant 모델 chondrocytes 제자리에 의 기계적인 취약점을 공부에 더 큰 동물 모델을 통해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 특히, 그들의 작은 크기 때문에 이러한 모델 완전히 그대로 관절 연골의 기본 조직의 무결성을 변경 하지 않고 테스트 촉진 한다. 또한, 로드 murine 연골의 발생 작은 접촉 지역에 같은 chondrocyte 사망/부상 작은 부하로 유도 될 수 있다 (< 1 N). 마지막으로, 마우스 게놈은 쉽게 조작, 어떻게 특정 유전자 영향의 기계적 상해 chondrocytes 제자리에 의 민감성을 테스트 가능.
이 원고에 도입 하는 방법의 전반적인 목표는 계량 하 고 시각화에 진짜 시간에서 공간 정도 완전히 그대로 마우스 연골에 뼈에 적용 된 기계 부하 때문 에 원래의 세포 죽음/상해의 explants 에 체 외. 이 방법은 현미경 실장 장치 비슷한 우리가 최근 개발 테스트 플랫폼을 사용 하 여 극히 스테인드 explants의 기계적 테스트 다음 chondrocyte 생존을 손상 없이 마우스 활 액 관절의 조심 해 부 요구 계량 murine 연골 기계적 성질16하. 기계적 테스트 하는 동안 해 부 뼈의 (그대로) 관절 표면의 큰 부분 부하를 적용 한 후 세포 생존 능력의 신속한 분석을 활성화 한 형광 현미경 사진에 표시 됩니다. 비슷한 분석 murine 연골 explants의 표면 세포 생존 능력의 이전, 하지만 로드17의 동시 신청 없이 수행 되었습니다. 우리의 방법의 잠재 애플리케이션으로 감도 감소 시키기 위한 치료 뿐만 아니라 다른 제어 환경 및 기계적 조건, 관절 chondrocytes의 취약점 조사를 비교 연구 기계적 부하를 chondrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 방법 기계적 부하 또는 충격 처방 후 마우스 관절에서 관절 chondrocytes 실용적이 고 부상/죽은 현장에서 시각화를 성공적으로 채택 되었다. 특히, 우리는 두 개의 서로 다른 활 액 관절에서 완전히 그대로 관절 연골 내 chondrocytes의 기계적인 취약점 분석 수 있었다: 무릎 관절 (원심 화관)와 어깨 (humeri). 우리의 대표적인 결과 관절 표면에 세포 상해의 공간 정도 부하 크기와 충격…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 pH 미터 및 osmometer의 관대 한 사용에 대 한 박사 리처드 Waugh와 루이스 Delgadillo을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자 안드레아 리 기계 테스트 시스템의 초기 발전에 기여 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH P30 AR069655에 의해 투자 되었다.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
