Visualizzazione in tempo reale e analisi di condrociti lesioni dovute a carichi meccanici in espianti di cartilagine murina completamente intatta
Summary
Presentiamo un metodo per valutare l’estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni murini intatte dopo l’applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come osteoartrite, fattori genetici e/o i regimi differenti di carico influenzano la vulnerabilità dei condrociti in situ .
Abstract
Omeostasi della cartilagine articolare dipende la vitalità delle cellule residenti (condrociti). Purtroppo, il trauma meccanico può indurre morte del chondrocyte diffusa, che portano potenzialmente al guasto irreversibile del giunto e l’insorgenza dell’osteoartrite. Inoltre, mantenimento della vitalità dei condrociti è importante nelle procedure di innesto osteocondrali per ottimale risultati chirurgici. Presentiamo un metodo per valutare l’estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine intatte dopo l’applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato in studi comparativi per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche, nonché diversi stadi di degenerazione della cartilagine sul breve – e/o a lungo termine vulnerabilità dei chondrocytes articolari in situ. L’obiettivo del protocollo introdotto nel manoscritto è quello di valutare l’estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine. Soprattutto, questo metodo consente test su cartilagine completamente intatta, senza compromettere le condizioni al contorno native. Inoltre, consente la visualizzazione in tempo reale dei chondrocytes articolari vitale macchiato e singola analisi basata su immagini di lesione delle cellule indotta dall’applicazione di statica controllata e i regimi di carichi d’urto. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che in espianti di cartilagine sana, l’estensione spaziale della lesione delle cellule dipende sensibilmente intensità di carico di ampiezza e impatto. Il nostro metodo può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche diverse vulnerabilità della meccanica di in situ chondrocytes articolari.
Introduction
Cartilagine articolare (AC) è un tessuto che copre e protegge le ossa nelle articolazioni sinoviali, fornire liscia articolazioni portanti. Omeostasi del tessuto sono dipendente la vitalità dei condrociti, il tipo di suola delle cellule che risiedono in AC. Tuttavia, l’esposizione della cartilagine a forze estreme dovuto il trauma (ad esempio, cadute, lesioni incidente o sport veicolo) o a causa di instabilità articolare post-traumatica può indurre la morte del chondrocyte, che conduce alla rottura irreversibile dell’articolazione (artrosi) 1. Inoltre, in osteochondral procedure che mirano a riparare difetti localizzati in cartilagine danneggiata di innesto, trauma meccanico inserimento-collegata di innesto riduce la vitalità dei condrociti e ha effetti nocivi sui risultati chirurgici2.
Cartilagine explant modelli sono comunemente usati per studiare la suscettibilità dei chondrocytes articolari alla morte delle cellule indotta meccanicamente. Questi modelli utilizzano in genere espianti di grandi animali per studiare gli effetti di caricamento delle condizioni, condizioni ambientali e altri fattori sulla cella vulnerabilità3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Tuttavia, a causa delle grandi dimensioni delle articolazioni native, questi modelli generalmente richiedono la rimozione di una spina dalla superficie articolare di un giunto intatto, quindi compromettere native condizioni al contorno. Inoltre, che in genere richiedono l’applicazione di grandi carichi meccanici per indurre la lesione delle cellule. In alternativa, cartilagine murina explant modelli offrono diversi vantaggi rispetto ai modelli più grandi animali nello studiare la vulnerabilità meccanica dei condrociti in situ . In particolare, per le loro dimensioni più piccole, questi modelli facilitano l’ispezione della cartilagine articolare completamente intatta senza alterare l’integrità del tessuto nativo. Inoltre, caricamento della cartilagine murina si verifica sopra piccole aree di contatto che condrociti morte/lesione può essere indotta con piccoli carichi (< 1 N). Infine, il genoma di topo è facilmente gestibili, prove di impatto come specifico geni la suscettibilità dei condrociti in situ al danno meccanico.
L’obiettivo generale del metodo introdotto in questo manoscritto è quello di quantificare e visualizzare in real-time-il limite spaziale di in situ delle cellule morte/lesioni a causa di carichi meccanici applicati su cartilagine-su–osso del mouse completamente intatto in vitrodi espianti. Questo metodo richiede la dissezione attenta delle articolazioni sinoviali del mouse senza compromettere la vitalità dei condrociti, seguita da prove meccaniche di espianti vitale macchiati utilizzando un microscopio-montato dispositivo simile a una piattaforma di prova che abbiamo recentemente sviluppato per quantificare la cartilagine murina proprietà meccaniche16. Durante le prove meccaniche, una grande porzione della superficie articolare (intatta) dell’osso sezionato è visibile su una microfotografia di fluorescenza singolo, l’attivazione rapida analisi di attuabilità delle cellule dopo è applicato un carico. Una simile analisi di attuabilità delle cellule superficiali in espianti di cartilagine murino è stata eseguita in precedenza, ma senza applicazione simultanea di carico17. Possibili applicazioni del nostro metodo comprendono studi comparativi per studiare la vulnerabilità dei chondrocytes articolari a diverse condizioni ambientali e meccaniche controllate, così come la selezione di trattamenti volti a ridurre la sensibilità dei condrociti a carico meccanico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi sopra descritti sono stati impiegati con successo visualizzare praticabile e feriti/morti in situ chondrocytes articolari dalle articolazioni del mouse dopo prescritto impatti o carichi meccanici. In particolare, siamo stati in grado di analizzare la vulnerabilità meccanica dei condrociti all’interno della cartilagine articolare completamente intatto da due diverse articolazioni sinoviali: l’articolazione del ginocchio (femore distale) e spalla (Omero). I nostri risultati rappresentativi indicano che l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Richard Waugh e Luis Delgadillo per l’uso generoso di loro pH-metro e Osmometro. Inoltre, gli autori vorrei ringraziare Andrea Lee per contribuire allo sviluppo iniziale del sistema collaudo meccanico. Questo studio è stato finanziato dal NIH P30 AR069655.
Materials
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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