Histochemische kleuring en beeldanalyse te kwantificeren van zetmeel in de eierstok Primordia van zoete kers tijdens de Winter-rustperiode te combineren

Summary

Presenteren we een methodologie om te kwantificeren van het zetmeelgehalte in de eierstok primordia in zoete kers (Prunus avium L.) tijdens de winter-rustperiode met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gecombineerd met histochemische technieken.

Abstract

Veranderingen in zetmeel in kleine structuren zijn gekoppeld aan belangrijke gebeurtenissen tijdens verschillende plant ontwikkelings processen, waaronder de reproductieve fase van bestuiving tot bevruchting en het begin van de vruchtzetting. Echter variaties in zetmeel tijdens bloem differentiatie niet volledig bekend zijn, voornamelijk als gevolg van de moeilijkheid van het zetmeelgehalte in de met name kleine structuren van de bloem primordia kwantificeren. Hier beschrijven we een methode voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia van zoete kers (Prunus avium L.) met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gekoppeld aan de Microscoop, waarmee de betreffende de wijzigingen in de inhoud van de zetmeel met de verschillende fasen van ruststadia van herfst naar het voorjaar. Voor dit doel, wordt de status van de rustperiode van bloemknoppen bepaald door de evaluatie van de groei van de kiem van scheuten overgedragen aan gecontroleerde omstandigheden op verschillende momenten in de winter. Voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia, bloemknoppen zijn sequentieel verzameld, vaste, ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gekleurd met I₂Kl (kalium jodide-jodium). Preparaten worden waargenomen onder de Microscoop en geanalyseerd door een afbeelding-analyzer die duidelijk zetmeel van de achtergrond onderscheidt. Zetmeel inhoud waarden worden verkregen door het meten van de extinctie van de afbeelding die correspondeert met de gekleurde zetmeel, gelet op de som van de extinctie van elke pixel als een schatting van het zetmeelgehalte van het frame studeerde.

Introduction

Gematigde houtachtige planten aan te passen aan de seizoenen door modulerende hun groei en ontwikkeling. Terwijl ze tijdens de lente en de zomer ontwikkelen, stoppen ze met groeien in het najaar te gaan slapend in winter¹. Hoewel ruststadia hen in staat stelt om te overleven bij lage wintertemperaturen, is koelen een voorwaarde voor een goede budburst in voorjaar². De belangrijke implicaties rustperiode in gematigde fruitteelt- en bosbouw van hebben geleid tot diverse inspanningen om te bepalen en te voorspellen de rustperiode periode³. In boom fruitsoorten, empirische experimenten overdracht van scheuten aan het dwingen van voorwaarden en statistische voorspellingen op basis van gegevens van de bloei zijn huidige benaderingen om te bepalen van de datum van het breken rustperiode, waarmee onderzoekers te schatten van de koeling eisen voor elke cultivar. Het bepalen van de status van de rustperiode op basis van biologische processen blijft echter onduidelijk³.

Bloei in gematigde fruitbomen, zoals zoete kers (Prunus avium L.), gebeurt eenmaal per jaar en duurt ongeveer twee weken. Echter beginnen bloemen te differentiëren en ontwikkelen van ongeveer 10 maanden eerder, tijdens de vorige zomer⁴. Bloem primordia stoppen met groeien in het najaar te blijven slapende binnen de knoppen in de winter. In deze periode moet elke cultivar accumuleren een bepaalde koelen vereiste voor goede bloei⁴. Ondanks het ontbreken van fenologische veranderingen in de knoppen in de winter, bloem primordia fysiologisch actief zijn tijdens de rustperiode en de accumulatie van koelen temperaturen heeft onlangs in verband gebracht met de dynamiek van de accumulatie van zetmeel of verkleinen binnen de cellen van de eierstok primordium, biedt een nieuwe aanpak voor ruststadia bepaling⁵. Echter, de geringe omvang en de locatie van de eierstok primordium vereisen een speciale methodologie.

Zetmeel is de grote opslag koolhydraat in houtige plant soorten⁶. Dus, veranderingen in zetmeel verband met de fysiologische activiteit van de weefsels van de bloem, die koolhydraten moeten ter ondersteuning van hun ontwikkeling^7,8. Verschillende belangrijke gebeurtenissen tijdens het reproductieve proces zijn ook gerelateerd aan variaties in zetmeelgehalte in verschillende bloemen structuren, zoals helmknop meiose⁹, de groei van de stuifmeel-buizen door middel van de stijl of zaadknop bevruchting¹⁰. Histochemische technieken zorgen ervoor dat het zetmeel in elke specifieke weefsel van de bloem primordia tijdens de rustperiode. Het probleem blijft echter in het kwantificeren van dat zetmeel om na haar patroon van accumulatie/daling in tijd of in het zetmeel vergelijken inhoud onder weefsels, cultivars of jaren. Dit is te wijten aan de kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar voor de analytische technieken¹¹. Als alternatief kan beeldanalyse gekoppeld aan microscopie¹² de kwantificering van het zetmeel in zeer kleine steekproeven van plant weefsel¹³.

Benaderingen combineren microscopie en beeld analyse zijn gebruikt voor het kwantificeren van de inhoud van verschillende onderdelen in plantaardige weefsels, zoals de callose¹⁴, slangen¹⁵, of¹⁶, door het meten van de grootte van het gebied geverfd door specifieke zetmeel vlekken. Voor zetmeel, dit kan worden gemakkelijk gedetecteerd met behulp van de kaliumjodide-jodium (ik₂KI) reactie¹⁷. Deze methode is zeer specifiek; Ik₂KI intercalates binnen de laminaire structuur van zetmeel korrels en vormt een donker blauwe of roodbruine kleur, afhankelijk van de inhoud van de amylose van de zetmeel-¹⁸. Secties gekleurd met I₂KI vlek Toon voldoende contrast tussen zetmeel en het weefsel van de achtergrond, waardoor de detectie van een ondubbelzinnige zetmeel en de daaropvolgende kwantificering door de afbeelding analyse systeem¹⁹. Hoewel deze kleurstof niet stoichiometrische is, is de accumulatie van jodium evenredig aan de lengte van het zetmeel-molecuul, die sterk van^{17 variëren kan}. Dus, de grootte van de gebrandschilderde gebied, uitgedrukt als het aantal pixels kan niet weerspiegelen nauwkeurig de inhoud van zetmeel, aangezien hoge verschillen in zetmeelgehalte kon worden gevonden tussen velden met gekleurde gebieden van vergelijkbare grootte. Als alternatief kan het zetmeelgehalte worden geëvalueerd door het meten van de extinctie van de gekleurde korrels op zwart-witafbeeldingen verkregen van de Microscoop, zoals het is gemeld in verschillende weefsels in abrikoos^{8,13 , 19}, avocado^10,20, en olijf²¹.

Hier beschrijven we een methodologie die de experimentele bepaling van de status van de rustperiode met de kwantificering van zetmeelgehalte in de eierstok primordium weefsel van herfst combineert naar het voorjaar in zoete kers, het aanbieden van een nieuwe tool voor het begrip en de voorspelling rustperiode op basis van de studie van de biologische mechanismen van gekoppeld rustperiode.

Protocol

1. ruststadia vastberadenheid en Plant materiaal collectie Proef de bloemknoppen in het veld. Ruststadia studies zijn op lange termijn experimenten en vereisen volwassene bomen groot genoeg voor het verzamelen van de toppen en schiet alle winter zonder afbreuk te doen aan de bomen ontwikkeling in het volgende voorjaar. Speciale boomgaard beheer zou vereist afhankelijk van het opleidingssysteem; snoeien mag dus minder ernstig dan voor productiedoeleinden vruchten. Elke week, vanaf het begin van de herfst…

Representative Results

Ruststadia studies vereisen de bepaling van het moment wanneer het koelen eisen is voldaan. Ondanks het ontbreken van fenologische veranderingen in de winter onder veldomstandigheden (figuur 1A) herstellen cherry bomen niet de capaciteit van de groei onder passende voorwaarden totdat ze een bepaalde periode onder lage temperaturen geven. De regelmatige overdracht van scheuten aan een gecontroleerde omstandigheden kamer (figuur 1B…

Discussion

Rustperiode in houtachtige planten presenteert duidelijke gevolgen in fruitteelt- en bosbouw in een veranderend klimaat, hoewel het biologische proces achter ruststadia onduidelijk blijft. Ruststadia studies kunnen vanuit verschillende gezichtspunten worden benaderd, maar het onderzoek op zoek naar een biologische marker voor de winter-rustperiode is toegenomen de laatste jaren. Echter, zijn de meeste pogingen om te vinden een duidelijke indicator weergeven wanneer een knop ruststadia heeft gebroken mislukte<sup class="x…

Materials

Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550