Combinant la coloration histochimique et analyse d’images pour quantifier l’amidon dans les primordiums ovaire de cerises douces pendant la dormance hivernale

Summary

Nous présentons une méthode pour quantifier la teneur en amidon dans les primordiums ovaire dans sweet cherry (Prunus avium L.) au cours de la dormance hivernale à l’aide d’un système d’analyse image combiné avec des techniques histochimiques.

Abstract

Changements dans l’amidon dans des petites structures sont associées à des événements clés au cours de plusieurs processus de développement de la plante, y compris la phase reproductive de la pollinisation à la fécondation et le début de la fructification. Toutefois, des variations dans l’amidon pendant la différenciation de la fleur ne sont pas totalement connues, principalement en raison de la difficulté de quantifier la teneur en amidon dans les structures en particulier les petits des primordia fleur. Nous décrivons ici une méthode pour la quantification de l’amidon dans les primordiums ovaire de sweet cherry (Prunus avium L.) en utilisant un système d’analyse image attaché à la loupe, qui permet concernant les changements de teneur en amidon avec les différentes phases de la dormance de l’automne au printemps. À cette fin, l’état de dormance des bourgeons floraux est déterminée en évaluant la croissance des bourgeons des tiges transférée dans des conditions contrôlées à des moments différents de l’heure d’hiver. Pour la quantification de l’amidon dans les primordiums ovaire, boutons floraux sont séquentiellement recueillies, fixe, incorporé dans la paraffine, sectionnées et colorées avec j’ai₂Kl (iodure de potassium iodée). Préparations sont observées au microscope et analysées par un analyseur d’image qui la distingue clairement l’amidon de l’arrière-plan. Amidon contenus valeurs sont obtenues en mesurant la densité optique de l’image qui correspond à l’amidon coloré, considérant la somme de la densité optique de chaque pixel comme une estimation de la teneur en amidon du cadre étudié.

Introduction

Tempérées ligneuses vivaces s’adaptent aux saisons en modulant leur croissance et leur développement. Alors qu’ils développent au printemps et en été, ils cessent de croître au cours de l’automne pour aller en dormance en hiver¹. Bien que la dormance leur permet de survivre aux basses températures hivernales, réfrigération est une condition sine qua non pour un bon débourrement au printemps². Les répercussions importantes de dormance en production fruitière tempérées et des forêts ont conduit à divers efforts visant à déterminer et à prévoir la période de dormance³. Espèces d’arbres fruitiers, expériences empiriques transférant des pousses au forçage des conditions et des prévisions statistiques basées sur les données de la floraison sont les approches actuelles de déterminer la date de la rupture de la dormance, ce qui permet aux chercheurs d’estimer la exigences pour chaque cultivar de refroidissement. Cependant, comment déterminer l’état de dormance basé sur des processus biologiques reste peu clair³.

Floraison en fruitiers tempérés, comme sweet cherry (Prunus avium L.), se produit une fois par an et dure environ une quinzaine de jours. Cependant, les fleurs commencent à se différencier et de développer une dizaine de mois plus tôt, au cours de l’ été précédent⁴. Les primordiums fleur cesse de croître au cours de l’automne à rester dormant à l’intérieur des bourgeons en hiver. Au cours de cette période, chaque cultivar doit accumuler une exigence particulière paralysant pour bonne floraison⁴. Malgré l’absence de changements phénologiques dans les bourgeons en hiver, fleur primordiums sont physiologiquement actives en période de dormance, et l’accumulation des températures de réfrigération a été récemment associée à la dynamique de l’accumulation de l’amidon ou diminuer dans les cellules du primordium ovaire, offrant une nouvelle approche pour la détermination de dormance⁵. Toutefois, la petite taille et l’emplacement du primordium ovaire nécessitent une méthodologie particulière.

L’amidon est le glucide de stockage importants en espèces de plantes ligneuses⁶. Ainsi, les changements dans l’amidon ont été associés à l’activité physiologique des tissus fleur, qui ont besoin de glucides pour soutenir leur développement^7,8. Différents événements clés durant le processus de reproduction sont également liés aux variations de la teneur en amidon dans les différentes structures florales, tels que les anthères méiose⁹, la croissance des tubes polliniques dans le style ou ovule fécondation¹⁰. Des techniques histochimiques permettent la détection de l’amidon dans chaque tissu particulier des primordia fleur en période de dormance. Toutefois, la difficulté reste à quantifier cette fécule pour permettre à la suite de son modèle d’accumulation/diminution avec le temps, ou en comparant l’amidon contenu entre les tissus, les cultivars ou des années. Cela est dû à la petite quantité de tissu disponible pour les techniques d’analyse¹¹. Comme alternative, analyse d’image liée à la microscopie¹² permet la quantification de l’amidon dans très petits échantillons de plantes tissus¹³.

Microscopie et analyse d’images de la combinaison des approches ont été utilisées pour quantifier le contenu des différents composants dans les tissus végétaux, tels que de la callose¹⁴, microtubes¹⁵, ou¹⁶, l’amidon en mesurant la taille de la zone teintée par le particulier les taches. Pour l’amidon, il peut être facilement détecté à l’aide de l’iodure de potassium iodée (j’ai₂KI) réaction¹⁷. Cette méthode est très spécifique ; J’ai₂KI s’intercale au sein de la structure laminaire des grains d’amidon et forme une couleur bleue ou rouge-brun foncé, selon la teneur en amylose de l’ amidon¹⁸. Sections colorées avec I tache KI₂montrent un contraste suffisant entre l’amidon et le tissu de fond, ce qui permet une détection de l’amidon sans équivoque et la quantification ultérieure par l’image analyse système¹⁹. Bien que ce colorant n’est pas stoechiométrique, l’accumulation d’iode est proportionnelle à la longueur de la molécule d’amidon, qui peut varier fortement de¹⁷. Ainsi, la taille de la zone tachée, exprimée en nombre de pixels peut-être ne pas refléter avec précision la teneur en amidon, étant donné les différences de hautes teneur en amidon a pu être trouvées entre les champs avec des zones colorées de la même taille. Comme alternative, la teneur en amidon peut être évaluée en mesurant la densité optique des granules colorés sur des images noir et blanc obtenus à partir du microscope, il a été signalé dans différents tissus abricot^{8,13 , 19}, avocat^10,20et olive²¹.

Nous décrivons ici une méthodologie qui allie la détermination expérimentale de l’état de dormance de la quantification de la teneur en amidon dans le tissu ovarien de primordium de l’automne au printemps en cerisier, offrant un nouvel outil pour la compréhension et la prévision de dormance basée sur l’étude des mécanismes biologiques liés à la dormance.

Protocol

1. Collection matière dormance détermination et plante Les boutons floraux dans le domaine de l’échantillon. Études de dormance sont des expériences à long terme et adulte arbres assez grand pour recueillir les bourgeons et les pousses tout l’hiver sans compromettre le développement des arbres au printemps prochain. Gestion du verger spécial pourrait être requise selon le système de formation ; ainsi, l’élagage peut être moins sévère que pour fins de production de fruits. Chaque sem…

Representative Results

Études de dormance exigent la détermination du moment où les exigences de refroidissement sont réunies. Malgré l’absence de changements phénologiques pendant l’hiver dans des conditions naturelles (Figure 1 a), les cerisiers ne récupèrent pas la capacité de croissance dans des conditions appropriées jusqu’à ce qu’ils passent un certain temps sous des températures basses. Le transfert régulier des pousses à une chambre de conditions contrô…

Discussion

Dormance des plantes ligneuses vivaces présente des implications claires dans la production de fruits et des forêts au changement climatique, même si le processus biologique derrière la dormance reste floue. Études de dormance peuvent être abordés sous différents angles, mais la recherche à la recherche d’un marqueur biologique de dormance hivernale s’est intensifiée ces dernières années. Cependant, la plupart des tentatives pour trouver un indicateur sans équivoque montrant quand un bourgeon a cassé la…

Materials

Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550