Combina la coloración histoquímica y análisis de imagen para cuantificar el almidón en los primordios del ovario de cerezas durante la dormancia invernal
Summary
Se presenta una metodología para cuantificar el contenido de almidón en los primordios del ovario en cerezo dulce (Prunus avium L.) durante la dormancia invernal mediante el uso de un sistema de análisis de imagen combinado con técnicas histoquímicas.
Abstract
Cambios en el almidón en pequeñas estructuras se asocian a eventos clave durante varios procesos de desarrollo de planta, incluyendo la fase reproductiva de polinización, fecundación y el inicio de la fructificación. Sin embargo, variaciones en almidón durante la diferenciación de flores están completamente desconocidas, principalmente debido a la dificultad de cuantificar el contenido de almidón en las estructuras particularmente pequeños de los primordios de flores. Aquí, describimos un método para la cuantificación de almidón en los primordios del ovario de la cereza dulce (Prunus avium L.) mediante el uso de un sistema de análisis de imagen atado microscopio, que permite la relación con los cambios en el contenido de almidón con las diferentes fases de latencia de otoño a primavera. Para ello, el estado de dormancia de las yemas de flor se determina evaluando el crecimiento de yemas de brotes transferidos a condiciones controladas en diferentes momentos en época de invierno. Para la cuantificación de almidón en los primordios del ovario, capullos son secuencialmente recogidos, fijo, embebidos en parafina, seccionadas y teñidas con2Kl (yodo yoduro de potasio). Las preparaciones se observa bajo el microscopio y analizadas por un analizador de imagen que distingue claramente el almidón desde el fondo. Valores de contenido de almidón se obtienen midiendo la densidad óptica de la imagen que corresponde a almidón teñido, considerando la suma de la densidad óptica de cada píxel como una estimación del contenido de almidón del marco estudiado.
Introduction
Perennes leñosas templados se adaptan a las estaciones modulando su crecimiento y desarrollo. Mientras que se desarrollan durante la primavera y el verano, dejan de crecer durante el otoño para ir latentes en invierno1. Aunque la inactividad les permite sobrevivir a bajas temperaturas del invierno, escalofriante es un requisito previo para una adecuada brotación en primavera2. Las implicaciones importantes de inactividad en la producción de frutas de clima templado y bosques han provocado diversos esfuerzos para determinar y predecir el período de dormancia3. En especies frutales, experimentos empíricos transferencia brotes a forzar las condiciones y pronósticos estadísticos basados en datos de la floración son enfoques actuales para determinar la fecha de la ruptura del reposo invernal, que permite a los investigadores estimar la escalofriante los requisitos para cada cultivar. Sin embargo, cómo determinar el estado de latencia basado en procesos biológicos sigue siendo confuso3.
Floración en frutales templados, como la cereza dulce (Prunus avium L.), se produce una vez al año y dura aproximadamente dos semanas. Sin embargo, flores empiezan a distinguir y desarrollar unos 10 meses antes, durante el verano anterior4. Primordios de flores dejen de crecer durante el otoño para permanecer latente dentro de los brotes durante el invierno. En este período, cada cultivar tiene que acumular un requisito escalofriante especial para floración adecuada4. A pesar de la falta de cambios fenológicos en los brotes durante el invierno, primordios de flores son fisiológicamente activos durante la latencia, y la acumulación de temperaturas de refrigeración se ha asociado recientemente a la dinámica de acumulación de almidón o disminuir dentro de las células del primordio de ovario, que ofrece un nuevo enfoque para la determinación de latencia5. Sin embargo, el pequeño tamaño y la ubicación del primordio de ovario requieren una metodología especial.
El almidón es el carbohidrato principal de almacenamiento en plantas leñosas especies6. Por lo tanto, cambios en almidón han sido relacionados con la actividad fisiológica de los tejidos de la flor, que necesitan carbohidratos para apoyar su desarrollo7,8. Diferentes eventos claves durante el proceso reproductivo también están relacionadas con variaciones en el contenido de almidón en diferentes estructuras florales, como antera meiosis9, el crecimiento de los tubos de polen a través de la fertilización de estilo u óvulo10. Técnicas histoquímicas permiten la detección de almidón en cada tejido en particular de los primordios de flores durante la latencia. Sin embargo, la dificultad sigue siendo en la cuantificación de ese almidón para permitir después su patrón de acumulación o disminuir con el tiempo o comparar el almidón contenido entre tejidos, cultivares o años. Esto es debido a la poca cantidad de tejido disponible para el11de técnicas analíticas. Como alternativa, análisis de imagen vinculados a microscopia12 permite la cuantificación del almidón en muy pequeñas muestras de tejido de planta13.
Enfoques combinando análisis de microscopía e imagen se han utilizado para cuantificar el contenido de diferentes componentes en los tejidos vegetales, como el Callosa14, microtubos15, o16, midiendo el tamaño de la zona teñida por específico del almidón manchas. Para el almidón, puede ser fácilmente detectada mediante el yodo yoduro de potasio (I2KI) reacción17. Este método es altamente específico; I2KI intercala dentro de la estructura laminar de los granos de almidón y se forma un color azul o marrón rojizo oscuro, dependiendo del contenido de amilosa del almidón18. Secciones teñidas con mi mancha KI2Mostrar contraste adecuado entre el almidón y el tejido de fondo, permitiendo una detección inequívoca del almidón y la posterior cuantificación por el de sistema de análisis de imagen19. Aunque este colorante no es estequiométrica, la acumulación de yodo es proporcional a la longitud de la molécula de almidón, que puede variar muy17. Así, el tamaño de la zona manchada que se expresa como el número de píxeles puede no reflejar con precisión el contenido de almidón, ya que altas diferencias en contenido de almidón podrían encontrarse entre campos con áreas manchadas de tamaño similar. Como alternativa, el contenido de almidón puede ser evaluado midiendo la densidad óptica de los gránulos teñidos en blanco y negro imágenes obtenidas en el microscopio, como ha sido reportado en diversos tejidos en albaricoque8,13 , 19, aguacate10,20y oliva21.
Aquí, describimos una metodología que combina la determinación experimental del estado de latencia con la cuantificación del contenido de almidón en el tejido del primordio de ovario desde el otoño a la primavera en cerezas, ofreciendo una nueva herramienta para la comprensión y predicción de latencia basado en el estudio de los mecanismos biológicos relacionados con dormancia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dormición en plantas perennes leñosas presenta claras implicaciones en producción frutícola y forestal en un clima cambiante, aunque el proceso biológico detrás de latencia sigue siendo confuso. Estudios de dormancia pueden ser abordados desde diferentes puntos de vista, pero la investigación en busca de un marcador biológico para la dormancia invernal se ha intensificado en los últimos años. Sin embargo, la mayoría intenta encontrar un inequívoco indicador que muestra Cuándo un brote ha roto latencia ha sid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen con gratitud María Herrero y Eliseo Rivas por su útil discusión y consejos. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad — Fondo Europeo de Desarrollo Regional, la Unión Europea [número de concesión BES-2010-037992 para E. F.]; el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [números de concesión RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; y el Gobierno de Aragón, Fondo Social Europeo, la Unión Europea [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
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