Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

Summary

Wir präsentieren eine Methodik zur Quantifizierung des Stärkegehalts in den Eierstock Primordia in Süßkirsche (Prunus Avium L.) während der Winterruhe, mithilfe einer Bild-Analyse-System mit histochemische Techniken kombiniert.

Abstract

Veränderungen in Stärke in kleinen Strukturen sind verbunden mit wichtigen Ereignissen während mehreren Pflanze Entwicklungsprozesse, einschließlich der reproduktiven Phase von der Bestäubung zur Befruchtung und das Einsetzen der Fruchtkörper. Jedoch sind Abweichungen in der Stärke während der Blüte Differenzierung nicht vollständig, vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung des Stärkegehalts in den besonders kleinen Strukturen der Blume Primordia bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche (Prunus Avium L.) mithilfe einer Bildanalysesystem angeschlossen an das Mikroskop, wodurch im Zusammenhang mit den Veränderungen im Stärkegehalt mit den verschiedenen Phasen der Vegetationsruhe vom Herbst bis zum Frühling. Zu diesem Zweck wird die Dormanz Blütenknospen Statusermittlung durch die Auswertung der Knospe Wachstum der Triebe, die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Winterzeit in kontrollierten Bedingungen übertragen. Für die Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia Blütenknospen sind sequentiell gesammelt, fixiert, eingebettet in Paraffinwachs, geschnitten und gefärbt mit I₂Kl (Kaliumjodid-Jod). Die Vorbereitungen sind unter dem Mikroskop beobachtet und analysiert, indem ein Bild-Analysator, der Stärke deutlich vom Hintergrund unterscheidet. Inhaltswerte Stärke erhält man durch Messung der optischen Dichte des Bildes, die die gefärbten Stärke entspricht, unter Berücksichtigung der sich aus der optischen Dichte der einzelnen Pixel als eine Schätzung des Stärkegehalts des Rahmens studierte.

Introduction

Gemäßigte waldige Stauden passen sich den Jahreszeiten durch die Modulation, ihr Wachstum und ihre Entwicklung. Während sie im Frühling und Sommer zu entwickeln, aufhören sie zu wachsen im Herbst, im Winter¹schlafend gehen. Obwohl Dormanz bei niedrigen Temperaturen im Winter überleben kann, ist chillen Voraussetzung für eine ordnungsgemäße Knospenaustrieb im Frühjahr². Die wichtigen Implikationen der Vegetationsruhe in gemäßigten Obstproduktion und Forstwirtschaft führten zu vielfältigen Bemühungen zu bestimmen und Vorhersage der Dormanz Periode³. In Obst-Baum-Spezies, empirischer Experimente Übertragung Triebe zu zwingen, Bedingungen und statistische Vorhersagen basierend auf Daten der Blüte sind aktuelle Ansätze feststellen, das Datum für das Brechen der Keimruhe, wodurch Forscher schätzen die Chillen Anforderungen für jede Sorte. So erkennen Sie die Dormanz Status basierend auf biologische Prozesse bleibt jedoch unklar³.

Blüte im gemäßigten Obstbäume wie Süßkirsche (Prunus Avium L.), tritt einmal im Jahr und dauert etwa zwei Wochen. Allerdings beginnen Blumen zu differenzieren und rund 10 Monate früher, während der vergangenen Sommer⁴zu entwickeln. Blume Primordia aufhören zu wachsen im Herbst ruhend innerhalb der Knospen im Winter zu bleiben. In dieser Zeit muss jeder Sorte eine besondere kühle Voraussetzung für richtige Blüte⁴ansammeln. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen in den Knospen im Winter Blume Primordia sind physiologisch aktiv während der Vegetationsruhe und die Anhäufung von kühlen Temperaturen wurde vor kurzem assoziiert mit der Dynamik der Stärke Anhäufung oder verringern innerhalb der Zellen von der Eierstock Primordium bietet einen neuen Ansatz für Dormanz Bestimmung⁵. Die geringe Größe und die Position des Eierstocks Primordium erfordern jedoch eine spezielle Methodik.

Stärke ist das große Speicher-Kohlenhydrat im Gehölz Arten⁶. So haben Veränderungen in Stärke auf die physiologische Aktivität der Blume Gewebe, die brauchen Kohlenhydrate zur Unterstützung ihrer Entwicklung^7,8in Verbindung gebracht. Andere wichtige Ereignisse während der reproduktiven Prozesses beziehen sich auch auf Variationen in Stärkegehalt in verschiedenen floralen Strukturen, z. B. Anthere Meiose⁹, das Wachstum der Pollenschläuche durch den Stil oder Ovulum Befruchtung¹⁰. Histochemische Techniken ermöglichen die Erkennung von Stärke in jedem bestimmten Gewebe Blume Primordia während der Vegetationsruhe. Allerdings bleibt die Schwierigkeit bei der Quantifizierung dieser Stärke, im Anschluss an ihre Muster der Akkumulation/Abnahme über die Zeit oder die Stärke zu vergleichen zwischen Gewebe, Sorten oder Jahre Inhalte zulassen. Dies ist aufgrund der kleinen Menge an Gewebe für die analytische Techniken¹¹zur Verfügung. Als Alternative ermöglicht Bildanalyse, Mikroskopie¹² verbunden die Quantifizierung der Stärke in sehr kleine Proben von pflanzlichen Gewebe¹³.

Ansätze, die Kombination von Mikroskopie und Bildanalyse wurden zur quantifizieren des Inhalts der verschiedenen Komponenten in pflanzlichen Geweben, wie Kallose¹⁴, Mikroröhrchen¹⁵, oder¹⁶, durch Messung der Größe des Bereichs gefärbt durch spezifische Stärke Flecken. Für Stärke, kann leicht erkannt werden mit Kaliumiodid-Jod (ich₂KI) Reaktion¹⁷. Diese Methode ist sehr spezifisch; Ich₂KI Plasmamembrane innerhalb der laminaren Struktur der Stärke Körner und bildet eine dunkle blaue oder rötlich-braune Farbe, abhängig von der Amylosegehalt Stärke¹⁸. Abschnitte mit ich befleckt₂KI Fleck zeigen ausreichenden Kontrast zwischen Stärke und dem Hintergrund Gewebe, so dass eine eindeutige Stärke-Erkennung und der anschließenden Quantifizierung durch die Bild-Analyse-System¹⁹. Obwohl dieser Farbstoff nicht stöchiometrischen ist, ist die Anhäufung von Jod proportional zur Länge des Stärke-Moleküls, die¹⁷stark variieren kann. So kann die Größe des verschmutzten Bereich ausgedrückt als die Anzahl der Pixel nicht genau den Inhalt der Stärke, da hohe Unterschiede im Stärkegehalt zwischen Feldern mit gefärbten Bereiche ähnlicher Größe gefunden werden konnte. Als Alternative kann der Stärkegehalt ausgewertet werden durch die Messung der optischen Dichte der gefärbten Körnchen auf schwarz / weiß Bilder von dem Mikroskop ausgewiesen in verschiedenen Geweben in Apricot^{8,13 , 19}, Avocado^10,20und Olive²¹.

Hier beschreiben wir eine Methodik, die die experimentelle Bestimmung der Dormanz Status mit der Quantifizierung der Stärkegehalt in Primordium Eierstockgewebe vom Herbst kombiniert bis zum Frühling in süßen Kirschen, bietet ein neues Tool für das Verständnis und die Vorhersage der Vegetationsruhe basierend auf der Studie der biologischen Mechanismen im Zusammenhang mit Keimruhe.

Protocol

(1) Dormanz Entschlossenheit und Pflanze Materialkollektion Probieren Sie die Blütenknospen im Feld. Dormanz Studien sind Langzeitexperimente und benötigen Erwachsene groß genug Bäume Knospen zu sammeln und schießt den ganzen Winter ohne die Bäume Entwicklung im nächsten Frühjahr. Spezielle Obstgarten Management könnte je nach dem Trainingssystem erforderlich; so kann Beschneidung weniger schwerwiegend als für Produktionszwecke Obst sein. Jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austrei…

Representative Results

Dormanz Studien erfordern die Festlegung des Zeitpunkts, wann die abschreckenden Voraussetzungen erfüllt sind. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen während des Winters unter Feldbedingungen (Abbildung 1A) wiederherstellen Kirschbäume nicht die Kapazität des Wachstums unter geeigneten Bedingungen, bis sie einen bestimmten Zeitraum unter niedrigen Temperaturen passieren. Die regelmäßige Übertragung der Triebe zu einer kontrollierten Bedin…

Discussion

Dormanz in holzigen Stauden stellt deutliche Auswirkungen im Obstbau und Forstwirtschaft im Klimawandel, obwohl der biologische Prozess hinter Dormanz unklar bleibt. Dormanz Studien aus verschiedenen Blickwinkeln angegangen werden können, aber die Forschung auf der Suche nach einer biologischen Marker für die Winterruhe hat in den letzten Jahren intensiviert. Allerdings wurden die meisten Versuche, eine eindeutige Kennzeichen, wenn eine Knospe Dormanz gebrochen hat zu finden erfolglos³. Die hier…

Materials

Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550