In dit artikel tonen we hoe de absorberende microbiopsy-techniek is uitgevoerd en hoe de steekproef kan worden gebruikt voor RNA extractie voor eenvoudige en gelijktijdige sampling van huid en bloed op een minimaal invasieve manier.
Conventionele Huidbiopt beperkt het klinische onderzoek waarbij cosmetisch gevoelige zones of pediatric toepassingen vanwege haar invasiviteit. Hier beschrijven we het protocol voor het gebruik van een absorberende microneedle-apparaat, absorberende microbiopsy, voor minimaal invasieve bemonstering van huid en bloed mengsel. Ons doel is om te helpen bevorderen van snelle vorderingen bij klinisch onderzoek, de oprichting van biomarkers voor huidziekte en vermindering van het risico voor klinisch onderzoek deelnemers. In tegenstelling tot conventionele huid biopsie technieken, de absorberende microbiopsy kan worden uitgevoerd binnen seconden en vereist geen intensieve training dankzij het eenvoudige ontwerp. In dit verslag beschrijven we het gebruik van absorberende microbiopsy, met inbegrip van laden en de toepassing, op een vrijwilliger. Vervolgens laten we zien hoe RNA isoleren van de geabsorbeerde monster. Tot slot tonen wij het gebruik van kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) te meten van de mRNA niveaus van de expressie van zowel bloed (CD3E en CD19) en huid (KRT14 en TYR). De methoden die we beschrijven gebruiken uit de kits van de plank en reagentia. Dit protocol biedt een minimaal invasieve benadering voor gelijktijdige bemonstering van de huid en het bloed binnen dezelfde absorberende microbiopsy matrix. Wij hebben menselijke ethische commissies, clinici en vrijwilligers te steunen deze benadering van dermatologische onderzoek gevonden.
Huidbiopt is één van de meest essentiële technieken in Dermatologie voor bemonstering van de huid en daaropvolgende diagnose van de ziekten van de huid door histopathologisch evaluatie. De biopsie techniek omvat een medische professional met een mes of punch biopsie te verwijderen van de verdachte laesie op de huid van de patiënt voor onderzoek1. Hoewel de techniek effectief is, is het zeer invasieve en klinisch onderzoek beperkt zoals het eindpunt doorgaans2,3van de technieken van de moleculaire biologie behelst. Moleculaire analyse van ziekten van de huid heeft de potentie om zeer specifieke biologische informeren dat histopathologisch analyse kan niet, aldus drug discovery en ziekte diagnose4,5te vergemakkelijken. Bovendien, de vraag van de steekproef in meest moleculaire technieken is relatief klein en leiden tot een vermindering van dierlijke gebruik en toestaan een grotere aantal replicatieonderzoeken. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een alternatieve techniek die toelaat moleculaire analyse in klinisch onderzoek en verlaagt risico voor deelnemers.
Om aan te pakken die behoefte in het veld, heeft onze fractie een roman microneedle gebaseerde diagnostische platform, absorberende microbiopsy, waarmee de verzameling van een kleine hoeveelheid huid vermengd met bloed in een eenvoudige en minimaal invasieve manier6ontwikkeld. Het doel van deze publicatie is voor het beschrijven van de absorberende microbiopsy als een bemonstering instrument ter bevordering van moleculaire analyse door middel van RNA extractie in klinisch onderzoek.
Eerder, hebben we de eerste versie van microbiopsy, microbiopsy van de huid, die uit een microneedle gemaakt van een drie-lagen plaatstaal ontwerp bestaat te halen kleine stukjes van de huid weefsels7beschreven. De nieuwigheid van dit apparaat komt uit de meerdere contactpunten van de microneedle dat efficiënt weefsel extractie3 toelaat. In tegenstelling, een circulaire punch Huidbiopt biedt slechts één contactpunt en tranen gewoon de huid zonder het vastleggen van een monster in sommige gevallen. Op basis van de microbiopsy van de huid, ontwikkeld wij onlangs de absorberende microbiopsy die zowel bloed en huid bemonstering mogelijkheden heeft. Het apparaat heeft aangetoond dat haalbaar voor gebruik in resource-arme gebieden in een recente epidemiologische studie6.
Dankzij het eenvoudige ontwerp, de absorberende microbiopsy kan worden uitgevoerd binnen een paar seconden en vereist geen uitgebreide training. Bovendien, lokale verdoving is niet nodig, en de toepassing site veroorzaakt geen littekens. Dit protocol kan onderzoekers of medische professionals zonder relevante bemonstering opleiding om gerichte huid gegevens voor moleculaire analyse te verkrijgen. Wij verwachten microsampling apparaten tot routine in huid onderzoek in de toekomst.
Hoewel de microbiopsy in andere huid ziekte studies die moleculaire diagnostische technieken6,8,9,10, zoals humaan papillomavirus DNA detectie, dit protocol heeft gemeld is de eerste om aan te tonen van de details van de steekproef winning en verwerking technieken voor de absorberende microbiopsy. Verder, dit is het eerste verslag met een beschrijving van de relatieve gen expressie profilering van huid en bloedcellen in microbiopsy monsters.
Deze resultaten tonen aan dat de absorberende microbiopsy kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor eenvoudige en minimaal invasieve bemonstering van huid en bloed mengsel voor moleculaire karakterisering. Device-toepassing overeenkomstig onze protocol is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten zoals aangegeven door het verschil in RNA bedrag teruggevorderd met verschillende toepassingsprotocollen (Figuur 3). Zodra het monster wordt geëxtraheerd, is het latere monster verwerking stap voor RNA extractie zeer vergelijkbaar met gevestigde protocollen15,16. Bovendien van de eerste stappen in RNA extractie die zijn aangepast voor de absorberende microbiopsy, is een andere belangrijke wijziging het gebruik van RNase-gratis water ter verbetering van de resultaten voor downstream toepassingen. Bovendien is het vermeldenswaard dat het gen van de verwijzing in deze studie gebruikt RPLP0. RPLP0, waarvan de functie goed-gekend voor verschillende cellen en weefsel typen17 is, werd gerapporteerd als een geschikte referentiemiddelen gen voor gebruik in niet-melanoom huidkanker en voorstadia laesies18.
Een van de belangrijkste beperkingen van het apparaat is de verwijdering van de microbiopsy van het apparaat, dat is tijdrovend en potentieel verhoogt de kans op verlies van de steekproef, vooral voor gevoelige monsters zoals RNA. Echter kan het probleem worden verholpen door het vooraf koeling alle steriele processing tools, zoals de 2 mL microcentrifuge buizen, op droog ijs.
Het gebruik van de absorberende microbiopsy is eenvoudig en vereist geen intensieve training. Conventionele biopsie is niet nodig als microbiopsy moleculaire karakterisering met gevestigde moleculaire diagnostiek technieken, zoals RT-qPCR toelaat. Om verder te kwantificeren en de bemonstering aantonen van absorberende microbiopsy, was vorige literatuur die RNA extractie van menselijke huidweefsel onderzocht. Punch van een typische 3.0 of 4.0 mm huid biopsie, drie studies hebben gemeld de uitgepakte RNA bedragen varieerden van 50 tot 200 ng per mg huid weefsel19,20,21. Vergelijken met de 1,43 ng van RNA die was hersteld van de absorberende microbiopsy gemiddeld (Figuur 3), het gewicht van de bemonsterde huid weefsels naar bereik verwachting van 0,29-115 µg op basis van de dezelfde verhouding van het RNA-naar-weefsel van huid punch biopsie studies.
Dit protocol is niet zonder potentiële valkuilen, hoewel sommige van de problemen kan gemakkelijk worden overwonnen. Bijvoorbeeld, voorgesteld de RNA extractie gegevens een aanzienlijke variatie zelfs met de 10-s bedrijf tijd (Figuur 3). Om het probleem, omvat één mogelijke oplossing het optimaliseren van het toepassingsprotocol. Parameters zoals kracht toegepast op de huid en houden tijd moet worden getest en geoptimaliseerd voor het verminderen van de variaties in de extractie van het monster. De andere potentieel probleem is het verwijderen van microbiopsy van het apparaat, dat kan van invloed zijn de integriteit van de steekproef en het herstel. Hoewel het verwijderen van de microbiopsy voor RNA extractie een effectieve aanpak is, de gehele procedure is vervelend en het monster kan worden blootgesteld aan vervuiling in het proces. De wijziging van het protocol van de processing monster is daarom zeer gewenst om de integriteit van het monster en monster verlies te voorkomen.
Zodra de bovengenoemde twee kwesties worden aangepakt, wordt verwacht dat het apparaat een standaardhulpmiddel voor klinisch onderzoek zullen worden. Het is belangrijk op te merken dat het apparaat gelijktijdig zowel huid en bloed monster vangt en dit moet rekening worden gehouden bij het analyseren van gen expressie gegevens. Kortom, beschrijft dit protocol de details van de absorberende microbiopsy uitvoeren als een eenvoudig en minimaal invasieve hulpmiddel voor gecombineerde huid en bloedmonsters en het daaropvolgende monster verwerking voor relatieve gen expressie profilering.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen erkennen NHMRC Fellowships APP1109749 en APP1111216, Universiteit van Queensland Centennial beurs en internationaal postdoctoraal onderzoek beurs.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |