Dans cet article, nous montrons comment la technique de microbiopsy absorbant est effectuée et comment l’échantillon peut être utilisé pour l’extraction de l’ARN pour l’échantillonnage simple et simultanée de la peau et le sang de façon mini-invasive.
Biopsie cutanée classique limite la recherche clinique avec des domaines cosmétiquement sensibles ou des applications pédiatriques en raison de son caractère invasif. Nous décrivons ici le protocole afin d’utiliser un dispositif absorbant à base de microneedle, microbiopsy absorbant, pour mini-invasive d’échantillonnage de mélange de sang et de peau. Notre objectif est de contribuer à faciliter des progrès rapides dans la recherche clinique, la mise en place des biomarqueurs de la maladie de la peau et réduire les risques pour les participants à la recherche clinique. Contrairement aux techniques de biopsie de peau classique, le microbiopsy absorbant peut être effectuée en quelques secondes et ne nécessite pas de formation intensive grâce à son design simple. Dans ce rapport, nous décrivons l’utilisationdes microbiopsy absorbant, y compris le chargement et la demande, le bénévole. Ensuite, nous montrons comment isoler l’ARN de l’échantillon absorbée. Enfin, nous montrent l’utilisation de la transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) pour quantifier les niveaux d’expression de mRNA de sang (CD3E et CD19) et peau (KRT14 et TYR). Les méthodes que nous décrivons utilisent les kits de plateau et réactifs. Ce protocole offre une approche mini-invasive pour l’échantillonnage simultané de la peau et le sang au sein de la même matrice microbiopsy absorbant. Nous avons identifié les comités d’éthique humaine, des cliniciens et des bénévoles d’appuyer cette approche de la recherche en dermatologie.
Biopsie cutanée est une des techniques plus essentiels en dermatologie pour peau d’échantillonnage et diagnostic ultérieur des maladies de la peau au moyen d’évaluation histopathologique. La technique de biopsie consiste à un professionnel de la santé à l’aide d’une biopsie lame ou poinçon à retirer la lésion suspecte sur la peau du patient pour l’examen1. Bien que la technique soit efficace, il est très envahissante et limite la recherche clinique comme le point de terminaison fait habituellement appel à des techniques de biologie moléculaire2,3. Analyse moléculaire des maladies de la peau a le potentiel de fournir des informations biologiques très spécifiques qu’analyse histopathologique ne saurait, facilitant ainsi la drogue découverte et maladie diagnostic4,5. En outre, la demande d’échantillon de techniques moléculaires plus est relativement faible et peut entraîner une réduction de l’utilisation des animaux et permettre un plus grand nombre de répétitions. Par conséquent, il est clairement nécessaire pour une autre technique qui permet l’analyse moléculaire en recherche clinique et diminue les risques pour les participants.
Pour répondre à ce besoin dans le domaine, notre groupe a développé une plate-forme diagnostique microneedle roman, microbiopsy absorbant, ce qui permet la collecte d’une quantité infime de peau mélangée avec du sang dans une manière simple et peu invasive6. L’objectif de cette publication est de décrire la microbiopsy absorbant comme un outil d’échantillonnage pour faciliter l’analyse moléculaire grâce à l’extraction de l’ARN en recherche clinique.
Nous avons décrit précédemment, la première version de microbiopsy, microbiopsy de peau, qui se compose d’un micro aiguille faite d’un dessin de trois couches de tôle pour extraire les petits morceaux de tissus de peau7. La nouveauté de cet appareil vient de multiples points de contact de la micro aiguille qui permet d’extraction efficace tissu3. En revanche, une biopsie à l’emporte-pièce circulaire peau fournit qu’un seul point de contact et déchire tout simplement la peau sans capturer n’importe quel échantillon dans certains cas. Basé sur le microbiopsy de la peau, nous avons développé récemment le microbiopsy absorbant qui a tant de sang et de peau d’échantillonnage des capacités. Le dispositif s’est avéré être réalisable pour utilisation dans les régions pauvres en ressources dans une récente étude épidémiologique6.
Grâce à sa conception simple, le microbiopsy absorbant peut être effectuée en quelques secondes et ne nécessite pas de formation approfondie. En outre, anesthésique local n’est pas nécessaire, et le site d’application ne provoque pas de cicatrices. Le présent protocole permet aux chercheurs ou professionnels de la santé sans échantillonnage pertinente de formation pour obtenir des données pour l’analyse moléculaire ciblée de la peau. Nous prévoyons microprélèvement dispositifs pour devenir la routine dans la recherche sur la peau à l’avenir.
Bien que le microbiopsy a été signalée dans d’autres études de la maladie de peau qui implique des techniques de diagnostic moléculaire6,8,9,10, tels que les virus du papillome humain détection de l’ADN, ce protocole est le premier à démontrer les détails des techniques d’extraction et de traitement échantillon pour le microbiopsy absorbant. En outre, c’est le premier rapport décrivant le profil d’expression de gène relative de la peau et des cellules sanguines dans les échantillons de microbiopsy.
Ces résultats démontrent que la microbiopsy absorbante peut servir comme outil d’échantillonnage simple et peu invasive du mélange de sang et la peau pour la caractérisation moléculaire. Application du dispositif conformément à notre protocole est indispensable à l’obtention des résultats fiables, comme en témoigne la différence de montant de RNA récupérée à l’aide de protocoles d’application différentes (Figure 3). Une fois que l’échantillon est extrait, l’échantillon suivant traitement pas pour l’extraction de l’ARN est très similaire aux protocoles établis15,16. En outre, depuis les étapes initiales d’extraction d’ARN qui sont modifiés pour la microbiopsy absorbant, un autre changement clé est l’utilisation d’eau exempte de RNase pour améliorer les résultats pour les applications en aval. En outre, il est à noter que le gène de référence utilisé dans cette étude est RPLP0. RPLP0, dont la fonction est bien connue pour les différentes cellules et tissus types17, a été signalé comme un gène de référence approprié pour une utilisation dans les cancers cutanés non mélanocytaires et lésions précancéreuses18.
Une des limites principales de l’appareil est la suppression de la microbiopsy de l’appareil, ce qui prend du temps et augmente potentiellement le risque de perte d’échantillon, en particulier pour les échantillons sensibles comme RNA. Néanmoins, le problème peut être surmonté en refroidissement préalable de tous les outils de traitement stérile, tels que les tubes de microcentrifuge 2 mL, sur la glace sèche.
L’utilisation de la microbiopsy absorbant est simple et ne nécessite pas de formation intensive. Biopsie conventionnelle n’est pas nécessaire que microbiopsy permet la caractérisation moléculaire avec des techniques de diagnostic moléculaire établi, comme la RT-qPCR. Pour quantifier et démontrer la capacité de prélèvement de microbiopsy absorbant, littérature qui implique l’extraction de l’ARN du tissu de la peau humaine a été étudiée. Une peau de mm typique 3.0 ou 4.0 punch biopsie, trois études ont signalé les montants de RNA extraction variait de 50 à 200 ng par mg de tissu de peau19,20,21. En comparant avec les 1,43 ng d’ARN qui a été récupéré de l’absorbant microbiopsy en moyenne (Figure 3), le poids des tissus cutanés échantillonnée devrait se situer de 0,29 à 115 µg basé sur le même rapport de RNA-à-tissu provenant d’études de peau punch biopsie.
Ce protocole n’est pas sans écueils potentiels, bien que certains problèmes peuvent être facilement surmontés. Par exemple, les données d’extraction ARN a suggéré une variation considérable même avec le temps de 10 s retenue (Figure 3). Pour résoudre le problème, une solution consiste à optimiser le protocole d’application. Paramètres tels que la force appliquent sur la peau et temps de maintien doit être testé et optimisé pour réduire les variations dans l’extraction de l’échantillon. L’autre problème potentiel est l’élimination des microbiopsy de l’appareil, qui peut-être nuire à l’intégrité de l’échantillon et la récupération. Bien que le retrait de la microbiopsy pour l’extraction de l’ARN est une approche efficace, l’ensemble de la procédure est fastidieuse, et l’échantillon pourrait être exposé à la contamination dans le processus. Par conséquent, la modification du protocole de traitement échantillon est hautement souhaitée afin de garantir l’intégrité de l’échantillon et de prévenir la perte de l’échantillon.
Une fois que les deux questions ci-dessus sont abordées, il est prévu que l’appareil deviendra un outil standard pour la recherche clinique. Il est important de noter que l’appareil capte échantillon de peau et le sang en même temps et cela devrait prendre en considération lors de l’analyse des données d’expression de gène. En conclusion, ce protocole décrit les détails de l’exécution de microbiopsy absorbant comme un outil simple et peu invasif pour peau combinée et prélèvements sanguins et l’échantillon suivant de traitement pour le profil d’expression génique relatif.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier NHMRC bourses APP1109749 et APP1111216, University of Queensland Centennial Scholarship et bourse de recherche postdoctorale International.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |