Neste artigo, vamos demonstrar como a técnica de microbiopsy absorvente é executada e como a amostra pode ser usada para a extração de RNA para amostragem simples e simultânea de pele e sangue, de forma minimamente invasiva.
Biópsia de pele convencional limita a pesquisa clínica que envolve áreas cosmeticamente sensíveis ou pediátricas aplicações devido a sua capacidade de invasão. Aqui, descrevemos o protocolo de utilização de um dispositivo baseado em microneedle absorvente, absorvente, microbiopsy, para amostragem minimamente invasiva da mistura de pele e sangue. Nosso objetivo é ajudar a facilitar o rápido progresso na pesquisa clínica, o estabelecimento de biomarcadores para doenças de pele e reduzindo o risco para os participantes da pesquisa clínica. Em contraste com as técnicas de biópsia de pele convencional, o absorvente microbiopsy pode ser executada em poucos segundos e não requer treinamento intensivo devido ao seu design simples. Neste relatório, nós descrevemos o uso de absorvente microbiopsy, incluindo carregamento e aplicação, em um voluntário. Em seguida, mostramos como isolar o RNA da amostra absorvida. Finalmente, vamos mostrar o uso de quantitativo transcrição reversa PCR (RT-qPCR) para quantificar os níveis de expressão de RNAm de sangue (CD3E e CD19) e pele (KRT14 e TYR). Os métodos que descrevemos utilizam fora da prateleira kits e reagentes. Este protocolo oferece uma abordagem minimamente invasiva para a amostragem simultânea de pele e sangue, dentro da mesma matriz microbiopsy absorvente. Encontramos comités de ética humana, clínicos e voluntários para apoiar esta abordagem de pesquisa dermatológica.
Biópsia de pele é uma das técnicas mais essenciais em Dermatologia para amostragem de pele e posterior diagnóstico de doenças de pele, através da avaliação histopatológica. A técnica de biópsia envolve um profissional médico, usando uma lâmina ou um punção biópsia para remover a lesão suspeita na pele do paciente para exame1. Embora a técnica seja eficaz, é altamente invasivo e limita a pesquisa clínica, como o ponto de extremidade geralmente envolve técnicas de biologia molecular2,3. Análise molecular de doenças de pele tem o potencial de fornecer informações biológicas altamente específicas que não a análise histopatológica, facilitando assim a droga descoberta e doença diagnóstico4,5. Além disso, a demanda de amostra em técnicas moleculares mais é comparativamente pequena e pode levar a uma redução no uso de animais e permitir um maior número de repetições. Portanto, há uma clara necessidade de uma técnica alternativa que permite a análise molecular em pesquisa clínica e diminui o risco para os participantes.
Para atender a essa necessidade no campo, nosso grupo desenvolveu uma plataforma de diagnóstica baseados em microneedle romance, microbiopsy absorvente, que possibilita a coleta de uma pequena quantidade de pele misturada com sangue de uma forma simples e minimamente invasiva6. O propósito desta publicação é descrever o absorvente microbiopsy como uma ferramenta de amostragem para facilitar a análise molecular através da extração do RNA em pesquisa clínica.
Anteriormente, descrevemos a primeira versão do microbiopsy, pele microbiopsy, que consiste de um microneedle feito de um design de três camadas de chapa de aço para extrair pequenos pedaços de tecidos de pele7. A novidade deste dispositivo vem de múltiplos pontos de contacto de microneedle que permite a extração de tecido eficiente3. Em contraste, uma biópsia do perfurador de pele circular fornece apenas um ponto de contacto e simplesmente rasga a pele sem captura qualquer amostra em alguns casos. Com base no microbiopsy a pele, recentemente desenvolvemos o microbiopsy absorvente que tem tanto sangue e pele capacidades de amostragem. O dispositivo tem demonstrado ser viável para uso em áreas de poucos recursos em um recente estudo epidemiológico6.
Devido ao seu design simples, o microbiopsy absorvente pode ser realizada em poucos segundos e não requer treinamento extensivo. Além disso, anestésico local não é necessária, e o local de aplicação não provoca cicatrizes. O presente protocolo permite a pesquisadores ou profissionais médicos sem amostragem pertinente de treinamento para obter dados de pele direcionados para análise molecular. Esperamos microsampling dispositivos para se tornar rotina na investigação de pele no futuro.
Embora o microbiopsy tem sido relatada em outros estudos de doença de pele que envolveu técnicas de diagnóstico molecular6,8,9,10, como o vírus do papiloma humano deteção do ADN, este protocolo é o primeiro a demonstrar os detalhes das técnicas de extração e processamento de amostra para o microbiopsy absorvente. Além disso, este é o primeiro relatório descrevendo o perfil de expressão de gene relativo da pele e células do sangue em amostras de microbiopsy.
Estes resultados demonstram que o absorvente microbiopsy pode ser usado como uma ferramenta para amostragem simples e minimamente invasiva da pele e sangue mistura para caracterização molecular. Aplicativo de dispositivo em conformidade com o protocolo é essencial para a obtenção de resultados fiáveis como mostrado pela diferença na quantidade de RNA recuperada com os protocolos de aplicação diferentes (Figura 3). Uma vez que a amostra é extraída, a amostra subsequente processamento passo para extração do RNA é altamente similar a protocolos estabelecidos15,16. Além disso, desde os passos iniciais na extração de RNA que são modificados para o absorvente microbiopsy, outra mudança chave é a utilização de água livre de RNase para melhorar os resultados para aplicações a jusante. Além disso, vale mencionar que o gene de referência utilizado neste estudo é RPLP0. RPLP0, cuja função é conhecida por diferentes células e tecidos tipos17, tem sido relatado como um gene de referência adequado para uso em cânceres de pele não-melanoma e lesões pré-cancerosas18.
Uma das principais limitações do dispositivo é a remoção do microbiopsy do dispositivo, que é demorado e potencialmente aumenta a chance de perda de amostra, especialmente para amostras sensíveis como o RNA. No entanto, o problema pode ser superado por pré-resfriamento todas as ferramentas de processamento estéril, tais como os tubos de microcentrifuga de 2ml, em gelo seco.
O uso de microbiopsy o absorvente é simples e não requer treinamento intensivo. Biópsia convencional não é necessária, como microbiopsy permite a caracterização molecular com técnicas de diagnóstico molecular estabelecido, como RT-qPCR. Para ainda mais quantificar e demonstrar a capacidade de amostragem de absorvente microbiopsy, foi investigada a literatura anterior que envolveu a extração do RNA do tecido da pele humana. De uma típico 3.0 ou 4.0 mm da pele soco biópsia, três estudos relataram as quantidades de RNA extraídas variou de 50 a 200 ng por mg de pele tecido19,20,21. Comparando com a 1,43 ng do RNA que foi recuperado o absorvente microbiopsy em média (Figura 3), o peso dos tecidos da pele amostrados é esperado a gama de 0,29-115 µ g baseia-se a mesma proporção de RNA-de-tecido de estudos de biópsia da pele soco.
Este protocolo não é sem armadilhas potenciais, embora alguns dos problemas podem ser facilmente superados. Por exemplo, os dados de extração de RNA sugeriam uma considerável variação mesmo com o tempo de armazenagem de 10-s (Figura 3). Para resolver o problema, uma solução potencial envolve otimizando o protocolo de aplicação. Parâmetros como a força aplicada sobre a pele e tempo de armazenagem deve ser testado e otimizado para reduzir as variações na extração da amostra. O outro problema potencial é a remoção de microbiopsy do dispositivo, que possa afetar a integridade da amostra e a recuperação. Apesar de remover o microbiopsy para extração do RNA é uma abordagem eficaz, todo o procedimento é tedioso, e a amostra pode ser exposta a contaminação no processo. Portanto, a modificação do protocolo de processamento de amostra é altamente desejada a fim de garantir a integridade da amostra e evitar a perda de amostra.
Uma vez que as duas questões acima são abordadas, espera-se que o dispositivo se torne uma ferramenta padrão para pesquisa clínica. É importante notar que o dispositivo capta a pele e o sangue amostra simultaneamente, e isto deve ser tida em conta quando se analisa dados da expressão do gene. Em conclusão, este protocolo descreve os detalhes do absorvente microbiopsy se apresentar como uma ferramenta fácil e minimamente invasiva para pele combinada e recolha de amostras de sangue e a amostra subsequente processamento para perfil de expressão de gene relativo.
The authors have nothing to disclose.
Nós gostaríamos de reconhecer NHMRC bolsas APP1109749 e APP1111216, Universidade de Queensland centenário bolsa e bolsa de pesquisa pós-graduação internacional.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |