在本文中, 我们演示了吸收性微活检技术是如何执行的, 以及如何使用该样本提取 rna, 以微创的方式对皮肤和血液进行简单和同时的采样。
传统的皮肤活检限制了临床研究, 涉及化妆品敏感区域或儿科应用, 由于其侵入性。在这里, 我们描述了使用吸收式微针为基础的设备, 吸收性微活检, 以微创采样皮肤和血液混合物的协议。我们的目标是帮助促进临床研究的快速进展, 建立皮肤病的生物标志物, 降低临床研究参与者的风险。与传统的皮肤活检技术不同, 吸收性微活检可以在几秒钟内进行, 不需要密集的培训, 因为它的设计简单。在本报告中, 我们描述了吸收性微活检的使用, 包括加载和应用, 对志愿者。然后, 我们展示了如何从被吸收的样本中分离 rna。最后, 我们演示了使用定量逆转录酶链反应 (rt-qpcr) 来量化血液 (cd3e和cd19) 和皮肤 (krt14和tyr) 的 mrna 表达水平。我们描述的方法利用现成的试剂盒和试剂。该方案提供了一种微创方法, 用于在同一吸收性微活检基质内同时采集皮肤和血液。我们发现人类伦理委员会、临床医生和志愿者都支持这种皮肤病学研究的方法。
皮肤活检是皮肤科最重要的皮肤取样技术之一, 并通过组织病理学评估对皮肤病进行后续诊断。活检技术包括医疗专业人员使用刀片或打孔活检, 以清除病人皮肤上的可疑病变进行检查.虽然该技术是有效的, 它是高度侵入性和限制临床研究的终点通常涉及分子生物学技术2,3。皮肤病的分子分析有可能提供组织病理学分析所不能提供的高度特定的生物学信息, 从而促进药物发现和疾病诊断4,5。此外, 大多数分子技术的样品需求相对较小, 可能导致动物使用减少, 并允许更多的复制。因此, 显然需要一种替代技术, 使分子分析在临床研究中, 并降低参与者的风险。
为了满足该领域的这种需求, 我们的小组开发了一个新的基于微针的诊断平台, 吸收性微活检, 能够收集少量的皮肤混合血液在一个简单和微创的方式 6.本出版物的目的是将吸收性微活检描述为一种取样工具, 以便在临床研究中通过 rna 提取促进分子分析。
此前, 我们已经描述了第一个版本的微活检, 皮肤微活检, 它由一个由三层钢板设计制成的微针组成, 以提取微小的皮肤组织7。这种装置的新颖性来自于微针的多个接触点, 允许有效的组织提取3。相比之下, 圆形皮肤打孔活检只提供一个接触点, 在某些情况下只是撕裂皮肤, 而不捕获任何样本。基于皮肤微活检, 我们最近开发了吸收性微活检, 具有血液和皮肤采样能力。在最近的一项流行病学研究中, 该装置已被证明可以在资源贫乏地区使用.
由于其简单的设计, 吸收性微活检可以在几秒钟内进行, 不需要广泛的培训。此外, 不需要局部麻醉, 应用部位不会造成疤痕。本协议使没有相关抽样培训的研究人员或医疗专业人员能够获得有针对性的皮肤数据, 用于分子分析。我们预计微采样设备将成为未来皮肤研究的常规。
虽然微活检已被报道在其他皮肤病的研究 , 涉及分子诊断技术6,8,9,10, 如人类状瘤病毒 dna 检测 , 这一方案首次详细介绍了吸收性微活检的样品提取和处理技术。此外, 这是第一份描述微活检样本中皮肤和血细胞相对基因表达谱的报告。
这些结果表明, 吸收性微活检可作为一种工具, 用于简单和微创取样的皮肤和血液混合物的分子表征。根据我们的协议进行设备应用对于获得可靠的结果至关重要, 不同应用协议回收的 rna 量的差异就表明了这一点 (图 3)。一旦提取了样品, rna 提取的后续样品处理步骤与已建立的协议15,16非常相似。除了为吸收性微活检而修改的 rna 提取的初始步骤外, 另一个关键的变化是使用无 rnase 的水, 以改善下游应用的结果。此外, 值得一提的是, 本研究中使用的参考基因是rplp0。rplp0 的功能因不同的细胞和17类型而闻名, 据报道, rplp0 是用于非黑色素瘤皮肤癌和癌前病变18的合适参考基因。
该设备的主要限制之一是从设备中取出微活检, 这很耗时, 有可能增加样本丢失的机会, 特别是对 rna 等敏感样本而言。然而, 这个问题可以通过预冷却所有无菌加工工具, 如2毫升微型离心管, 在干冰上克服。
吸收性微活检的使用很简单, 不需要密集的训练。传统的活检是没有必要的, 因为微活检允许分子表征与既定的分子诊断技术, 如 rt-qpcr。为了进一步量化和展示吸收性微活检的取样能力, 研究了以往涉及从人体皮肤组织中提取 rna 的文献。从典型的3.0 或4.0 毫米皮肤打孔活检, 三项研究报告提取的 rna 量从50至200纳克每毫克皮肤组织 19,20,21。与平均从吸收性微活检中回收的1.43 纳气 (图 3) 相比, 根据皮肤冲床活检研究中相同的 rna-组织比, 采样皮肤组织的重量预计从0.29-115 微克不等。
这个协议并非没有潜在的陷阱, 尽管有些问题很容易克服。例如, rna 提取数据表明, 即使与10秒的保持时间有相当大的差异 (图 3)。为了解决这个问题, 一个潜在的解决方案涉及优化应用程序协议。应测试和优化应施加于皮肤的力和保持时间等参数, 以减少样品提取的变化。另一个潜在的问题是从设备中取出微活检, 这可能会影响样本的完整性和恢复。虽然去除用于 rna 提取的微活检是一种有效的方法, 但整个过程是繁琐的, 并且样品可能会在过程中受到污染。因此, 为了确保样品的完整性和防止样品丢失, 非常希望对样品处理协议进行修改。
一旦上述两个问题得到解决, 预计该设备将成为临床研究的标准工具。需要注意的是, 该设备同时捕获皮肤和血液样本, 在分析基因表达数据时应考虑到这一点。总之, 该协议描述了执行吸收性微活检的细节, 作为一个简单和微创的工具, 结合皮肤和血液取样和后续的样品处理的相对基因表达谱。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 nhmrc 的研究金 app1109749 和 app1111216, 昆士兰大学百年奖学金和国际研究生研究奖学金。
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |