In questo articolo, dimostriamo come viene eseguita la tecnica assorbente microbiopsy e come l’esempio può essere utilizzato per l’estrazione di RNA per campionamento semplice e simultanea della pelle e sangue in modo minimamente invasivo.
La biopsia della pelle convenzionale limita la ricerca clinica che coinvolge aree esteticamente sensibili o applicazioni pediatriche a causa della sua invasività. Qui, descriviamo il protocollo per l’utilizzo di un dispositivo basato su microneedle assorbente, microbiopsy assorbente, per campionamento minimamente invasiva della miscela di pelle e sangue. Il nostro obiettivo è quello di contribuire a facilitare il rapido progresso nella ricerca clinica, l’istituzione di biomarcatori per la malattia della pelle e riducendo il rischio per i partecipanti alla ricerca clinica. In contrasto con tecniche di biopsia della pelle convenzionale, il microbiopsy assorbente può essere eseguita in pochi secondi e non richiede addestramento intensivo grazie al suo design semplice. In questo rapporto, descriviamo l’uso di assorbenti microbiopsy, anche di carico e applicazione, il volontario. Quindi, vi mostriamo come isolare RNA dal campione assorbito. Infine, dimostriamo l’uso di quantitativa trascrizione d’inversione PCR (RT-qPCR) per quantificare i livelli di espressione di mRNA di sangue (CD3E e CD19) e la pelle (KRT14 e TYR). I metodi che descriviamo utilizzano fino la mensola kit e reagenti. Questo protocollo offre un approccio mini-invasivo per campionamento simultaneo di pelle e sangue all’interno della stessa matrice assorbente microbiopsy. Abbiamo trovato questo comitati di etica umana, medici e volontari per essere di supporto di questo approccio alla ricerca dermatologica.
La biopsia della pelle è una delle tecniche più essenziali in dermatologia per il campionamento della pelle e la successiva diagnosi di malattie della pelle attraverso la valutazione istopatologica. La tecnica di biopsia comporta un professionista medico con una lama o punch biopsia per rimuovere la lesione sospettosa sulla pelle del paziente per l’esame1. Anche se la tecnica è efficace, altamente invasiva e limita la ricerca clinica come punto finale coinvolge solitamente biologia molecolare tecniche2,3. Analisi molecolare di malattie della pelle ha il potenziale per fornire informazioni biologiche altamente specifiche che l’analisi istopatologica non può, facilitando così la droga scoperta e malattia diagnosi4,5. Inoltre, la richiesta di campione nelle tecniche più molecolare è comparativamente piccola e può portare ad una riduzione nell’uso di animali e consentono un numero maggiore di ripetizioni. Perciò, vi è un chiaro bisogno di per una tecnica alternativa che consente l’analisi molecolare nella ricerca clinica e riduce il rischio per i partecipanti.
Per affrontare tale necessità nel campo, il nostro gruppo ha sviluppato una piattaforma diagnostica basata su microneedle romanzo, microbiopsy assorbente, che consente la raccolta di una quantità molto piccola di pelle miscelata con sangue in un modo semplice e minimamente invasiva6. Lo scopo di questa pubblicazione è quello di descrivere l’assorbente microbiopsy come uno strumento di campionamento per facilitare l’analisi molecolare mediante estrazione di RNA nella ricerca clinica.
In precedenza, abbiamo descritto la prima versione di microbiopsy, microbiopsy della pelle, che consiste di un microneedle di un disegno di piatto d’acciaio di tre-strato per estrarre piccoli pezzi di pelle tessuti7. La novità di questo dispositivo viene da più punti di contatto da microneedle che permette di estrazione efficiente tessuto3. Al contrario, una biopsia del punzone circolare pelle fornisce un unico punto di contatto e semplicemente le lacrime la pelle senza catturare qualsiasi campione in alcuni casi. Basato sulla pelle microbiopsy, recentemente abbiamo sviluppato il microbiopsy assorbente che ha sia sangue e pelle capacità di campionamento. Il dispositivo è stato indicato per essere fattibile per uso in ambienti poveri di risorse in un recente studio epidemiologico6.
Grazie al suo design semplice, la microbiopsy assorbente può essere eseguita in pochi secondi e non richiede una formazione completa. Inoltre, anestetico locale non è necessaria, e il sito di applicazione non causare cicatrici. Il presente protocollo consente di ricercatori o medici professionisti senza campione rilevante di formazione per ottenere dati di pelle mirate per l’analisi molecolare. Ci aspettiamo Microcampionamento dispositivi di diventare routine nella ricerca della pelle in futuro.
Anche se il microbiopsy è stato segnalato in altri studi di malattia della pelle che ha coinvolto tecniche diagnostiche molecolari6,8,9,10, come il virus del papilloma umano rilevazione del DNA, questo protocollo è il primo per dimostrare i dettagli delle tecniche di estrazione e la lavorazione di campione per il microbiopsy assorbente. Ulteriormente, questo è il primo rapporto che descrive la relativa espressione genica della pelle e cellule del sangue in campioni di microbiopsy.
Questi risultati dimostrano che il microbiopsy assorbente può essere usata come strumento per campionamento semplice e minimamente invasiva della miscela di pelle e sangue per la caratterizzazione molecolare. Applicazione del dispositivo in conformità con il nostro protocollo è essenziale per ottenere risultati affidabili, come mostrato dalla differenza di RNA importo recuperato con differenti protocolli applicativi (Figura 3). Una volta che il campione viene estratto, l’esempio successiva elaborazione passo per estrazione del RNA è altamente simile a protocolli stabiliti15,16. Oltre ai primi passi nella estrazione di RNA che vengono modificati per il microbiopsy assorbente, un altro cambiamento chiave è l’uso di acqua RNAsi-libera per migliorare i risultati per applicazioni a valle. Inoltre, vale la pena ricordare che il gene di riferimento utilizzato in questo studio è RPLP0. RPLP0, cui la funzione è ben nota per differenti delle cellule e del tessuto tipi17, è stato segnalato come un gene di riferimento adeguato per l’uso in tumori cutanei non-melanoma e lesioni precancerose18.
Uno dei principali limiti del dispositivo è la rimozione di microbiopsy dal dispositivo, che richiede tempo e potenzialmente aumenta la probabilità di perdita del campione, specialmente per campioni sensibili come RNA. Tuttavia, il problema può essere superato da tutti gli strumenti di trattamento di sterilizzazione, come tubi di 2 mL microcentrifuga su ghiaccio secco di preraffreddamento.
L’uso della microbiopsy assorbente è semplice e non richiede una formazione intensiva. La biopsia convenzionale non è necessaria come microbiopsy permette la caratterizzazione molecolare con tecniche di diagnosi molecolare stabilita, ad esempio RT-qPCR. Per quantificare e dimostrare la capacità di campionamento di assorbente microbiopsy ulteriormente, è stata studiata letteratura precedente che ha coinvolto l’estrazione di RNA da tessuti di pelle umana. Da una tipico 3.0 o 4.0 millimetri pelle punch biopsia, tre studi hanno riferito gli importi di RNA estratti variavano da 50 a 200 ng per mg di pelle tessuto19,20,21. Paragonando l’1,43 ng di RNA che è stato recuperato dalla microbiopsy assorbente in media (Figura 3), il peso dei tessuti della pelle campionata è previsto alla gamma da 0,29-115 µ g basato sullo stesso rapporto del RNA–tessuto dagli studi di biopsia del punzone della pelle.
Questo protocollo non è senza trabocchetti potenziali, anche se alcuni dei problemi può essere facilmente superato. Ad esempio, i dati di estrazione di RNA ha suggerito una considerevole variazione anche con il tempo di tenuta 10-s (Figura 3). Per risolvere il problema, una potenziale soluzione coinvolge ottimizzare il protocollo di applicazione. Parametri quali la forza applicata sulla pelle e tempo di mantenimento deve essere testato e ottimizzato per ridurre le variazioni nell’estrazione del campione. L’altro problema potenziale è la rimozione del microbiopsy dal dispositivo, che potrebbe compromettere l’integrità del campione e il recupero. Anche se rimuovere il microbiopsy per l’estrazione di RNA è un approccio efficace, l’intera procedura è noiosa, e il campione potrebbe essere esposto a contaminazione nel processo. Di conseguenza, la modifica del protocollo di trattamento del campione altamente è voluta al fine di garantire l’integrità del campione e prevenire la perdita di campione.
Una volta che le due questioni di cui sopra sono indirizzate, si prevede che il dispositivo diventerà uno strumento standard per la ricerca clinica. È importante notare che il dispositivo acquisisce il campione di sangue e pelle contemporaneamente e questo dovrebbe essere presi in considerazione quando si analizzano i dati di espressione genica. In conclusione, questo protocollo descrive i dettagli di esecuzione microbiopsy assorbente come uno strumento facile e minimamente invasivo per pelle combinata e prelievo di sangue e il campione successivo di elaborazione per la relativa espressione genica.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo riconoscere NHMRC borse APP1109749 e APP1111216, University of Queensland Centennial borsa e borsa di ricerca post-laurea internazionale.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |