فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية
Summary
نقدم هنا، منهجيات لتقييم سلامة غشاء سبيرماتوزوان، ميزة خلوية المرتبطة باختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. يصف لنا ثلاث تقنيات لتقييم فلوريميتريك أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والأسفار الفحص المجهري الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية. وترد أيضا أمثلة للجمع بين المنهجيات.
Abstract
سبيرميوجرامس القياسية التي تصف نوعية الحيوانات المنوية معظمها يستند المعلمات الفسيولوجية والمرئية، مثل حجم السائل المنوي وتركيز وحركية والحركة التقدمية، ومورفولوجية الحيوانات المنوية والجدوى. غير أن أيا من هذه التقييمات جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. نظراً لأن الحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة يتوقف على سلامة الغشاء ووظائف داخل الخلايا، قد تمكن التقييم لهذه المعلمات تنبؤ أفضل من اختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. وهنا يصف لنا ثلاثة أساليب مجدية لتقييم جودة الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت الخاصة جنبا إلى جنب مع الأسفار مجهرية أو التدفق الخلوي التحليلات. تحليلات لتقييم سلامة غشاء البلازما باستخدام 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ويوديد propidium (PI)، سلامة الغشاء أكروسومال باستخدام fluorescein isothiocyanate مترافق بسام بيسوم agglutinin (فيتك-PSA) و سلامة غشاء الميتوكوندريا استخدام 5, 5 ‘, 6, 6’-تترا-الكلورو-1، 1 ‘، 3، 3’-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1). وترد أيضا مزيج من هذه الأساليب. على سبيل المثال، استخدام أننيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس). ونحن نعتقد أن هذه المنهجيات، التي تستند إلى دراسة الأغشية المني، مفيدة جداً لتقييم مدى جودة الحيوانات المنوية.
Introduction
سلامة ووظيفة الحيوانات المنوية الأغشية عدد قليل من العوامل التي تشير إلى بقاء الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة. غشاء البلازما يعمل كحاجز بين الأقسام داخل الخلية وخارج الخلية، وبالتالي الحفاظ على توازن ناضح الخلوية1. أي الإجهاد الذي يؤدي إلى الأضرار بسلامة غشاء البلازما قد يضعف التوازن والحد من القدرة على البقاء والتسميد وزيادة موت الخلية. على سبيل المثال، يقلل نعد بقاء الحيوانات المنوية نظراً الأضرار التي لحقت بغشاء البلازما، ونتيجة للتغيرات في درجات الحرارة والضغط التناضحي2. ذكرت سابقا أن تعريض الحيوانات المنوية الثور بتركيزات منخفضة من الملوثات المنقولة مثل والاترازين مبيدات الآفات، وبه ديامينوتشلوروتريازيني المستقلب الرئيسي أو ميكوتوكسين الأفلاتوكسين B1، يقلل من الحيوانات المنوية البقاء1،3 . وكان تحديد هذا بواسطة وسم الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل مع DAPI في تركيبة مع بي، التي تلزم للحمض النووي للخلايا بغشاء البلازما تالفة.
أكروسومي رد فعل (ع) ينطوي على الانصهار الغشاء الخارجي أكروسومي وغشاء البلازما السطحية أسفر عن الإفراج عن الإنزيمات أكروسومال4،5. هذه هي الأحداث الأساسية لاختراق zona pellucida ودمج مزيد من الحيوانات المنوية مع البويضات6. ولذلك، يشكل تقييم سلامة غشاء أكروسومال معلمة مفيدة لتقييم نوعية السائل المنوي وخصوبة الذكور7،،من89. عدة تقنيات الفلورسنت مناسبة للتحقق من سلامة acrosome، فيتك-السلطة الوطنية الفلسطينية أو بسا فيتك8،10. في دراساتنا السابقة، باستخدام أنماط بسا فيتك المصبوغة1،3، تقدم تعاريف دقيقة ل (ط) acrosome سليمة، (ثانيا) تلف غشاء acrosome و (ثالثا) كان رد فعل أكروسومي. في التقرير الحالي، وعلينا تقييم الوضع acrosome استخدام مخصصة للحيوانات المنوية التدفق الخلوي ومقارنة النتائج لتلك باستخدام مجهر الأسفار.
الميتوكوندريا هي العضيات متعدد الوظائف المعنية في، في جملة أمور، ATP التوليف، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وإشارات الكالسيوم والمبرمج. الاختلالات الوظيفية الفيزيولوجية، بما في ذلك العقم الذكور والإناث، ترتبط بتغيير الوظيفة المتقدرية11. يتم ترتيب في ميدبيسي الميتوكوندريا الحيوانات المنوية وتلعب دوراً حاسما في حركية الحيوانات المنوية12. من المقبول أيضا أن غشاء الميتوكوندريا العالية المحتملة (ΔΨm) يرتبط بحركية طبيعية والتسميد عالية القدرة13. وفي المقابل، ΔΨm منخفضة يرتبط بمستوى مرتفع من الأنواع الأكسجين التفاعلية وانخفاض معدل الإخصاب14. على الرغم من ذلك، يمكن أن تحفز الإجهاد الخلوية المركبات البيئية المختلفة، على سبيل المثال اختلال الغدد الصماء، ويؤدي إلى زيادة مؤقتة في ΔΨm، فرط الاستقطاب1،3، وزيادة إنتاج الجذور الحرة، وفي نهاية المطاف، [ابوبتوسس]15. التحقيق الفلورسنت 6، 5، 5 ‘، 6’-تترا-الكلورو-1، 1 ‘، 3، 3’-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1) تمكن على سبيل المثال، بدراسة آثار السموم المنقولة على الحيوانات المنوية ΔΨm1،3.
سبيرميوجرامس القياسية، استناداً إلى المعلمات الفسيولوجية والمورفولوجية، ليست جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. أساليب أكثر دقة مطلوبة لضمان جودة الحيوانات المنوية. هنا، نحن نقدم اثنين من الأساليب الممكنة لتحديد نوعية الحيوانات المنوية على أساس تقييمات أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ رباعية متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والفحص المجهري الأسفار، ووصف لنا الدراسات1،3 ومؤخرا استخدمت الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية، في المختبر، وسبق استخدامها من قبل الآخرين16،،من1718.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحيوانات المنوية إخصاب محتمل يعتمد على عوامل متعددة تعكس نوعيته. تركيزات عالية من المني ونسبة عالية من المني متحركة عالية تدريجيا قد يعتبر السائل المنوي عالية الجودة. ومع ذلك، مثل هذا تقييم لا تأخذ في الاعتبار المعلمات الخلوية والفنية الأخرى. استخدام سيتوميتير ميكروكابيلاري ‘مقاعد البد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر “سيون” شركة إسرائيلية للتلقيح الاصطناعي، وتربية (حاييم هافيتز، إسرائيل) لمساعدتهم والتعاون، والسيدة لي نا (التكنولوجيات IMV، L’Aigle، فرنسا) للحصول على المساعدة مع أداة الإعداد والتدريب.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
