Fluorimetrica tecniche per la valutazione delle membrane degli spermatozoi
Summary
Qui, presentiamo le metodologie per valutare l’integrità della membrana di spermatozoan, una cellulare caratteristica associata con competenza di fertilizzazione dello sperma. Descriviamo tre tecniche per la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi: macchiatura simultanea con sonde fluorescenti specifiche, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate. Inoltre vengono presentati esempi di combinazione delle metodologie.
Abstract
Spermiograms standard che descrivono la qualità dello sperma sono principalmente basati sui parametri fisiologici e visual, come il volume di liquido seminale e concentrazione, motilità e motilità progressiva e morfologia degli spermatozoi e vitalità. Tuttavia, nessuna di queste valutazioni è abbastanza buona per predire la qualità dello sperma. Dato che il mantenimento della vitalità degli spermatozoi e fecondazione potenziale dipende dalla funzionalità intracellulare e l’integrità della membrana, la valutazione di questi parametri potrebbe consentire una migliore previsione di competenza di fertilizzazione dello sperma. Qui, descriviamo tre possibili metodi per valutare la qualità dello sperma usando sonde fluorescenti specifiche combinate con analisi di citometria a flusso o microscopia di fluorescenza. Analisi ha valutato l’integrità della membrana del plasma utilizzando 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e ioduro di propidio (PI), l’integrità della membrana acrosomiale utilizzando fluoresceina isotiocianato-coniugato dell’agglutinina Pisum sativum (FITC-PSA) e l’integrità della membrana mitocondriale usando 5, 5′, 6, 6′-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1). Combinazioni di questi metodi inoltre sono presentati. Per esempio, uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico). Crediamo che queste metodologie, che si basano sull’esame di membrane di spermatozoo, sono molto utili per la valutazione della qualità dello sperma.
Introduction
L’integrità e la funzionalità delle membrane degli spermatozoi sono alcuni dei fattori che indica la vitalità degli spermatozoi e potenziale di fecondazione. La membrana plasmatica agisce come una barriera tra compartimenti intracellulari ed extracellulari, mantenendo l’ equilibrio osmotico cellulare1. Qualsiasi stress che induce il danno all’integrità della membrana plasmatica potrebbe alterare l’omeostasi, ridurre la capacità di fertilizzazione e redditività e aumentare la morte delle cellule. Per esempio, crioconservazione riduce la vitalità degli spermatozoi causa danni alla sua membrana plasmatica, a seguito di variazioni di temperatura e stress osmotico2. Precedentemente abbiamo segnalato che esponendo lo sperma di Toro a basse concentrazioni di contaminanti di origine alimentare come i pesticidi atrazina, suo principale metabolita diaminochlorotriazine o l’aflatossina B1, la micotossina riduce sperma attuabilità1,3 . Questo è stato determinato dall’etichettatura il DNA double-stranded con DAPI in combinazione con PI, che si lega al DNA delle cellule con una membrana plasmatica danneggiata.
Reazione acrosomiale (AR) comporta la fusione della membrana acrosomiale esterna e la membrana di plasma sovrastante conseguente rilascio di enzimi acrosomiali4,5. Questi sono eventi da non mancare per penetrazione della zona pellucida e ulteriormente l’Unione dello sperma con l’ ovocita6. Pertanto, la valutazione dell’integrità della membrana acrosomiale costituisce un parametro utile per valutare la qualità dello sperma e la fertilità maschile7,8,9. Parecchie tecniche fluorescenti sono utilizzabili per la verifica di integrità acrosomiale, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. Nei nostri studi precedenti, utilizzando i modelli di FITC-PSA colorazione1,3, abbiamo fornito le definizioni precise per (i) acrosomiale intatta, (ii) danneggiato della membrana acrosomiale e (iii) ha reagito acrosomiale. Nel rapporto corrente, valutiamo lo stato acrosomiale mediante citometria a flusso di sperma-dedicato e confrontare i risultati con quelli utilizzando la microscopia a fluorescenza.
I mitocondri sono organelli multifunzionali coinvolti in, tra le altre cose, ATP sintesi, produzione di specie reattive dell’ossigeno, segnalazione del calcio e apoptosi. Disfunzioni fisiologiche, tra cui l’infertilità maschile e femminile, sono associate con la funzione mitocondriale alterata11. I mitocondri dello sperma sono disposti nel midpiece e svolgono un ruolo cruciale in spermatozoi motilità12. È ben accettato che potenziale di membrana mitocondriale alta (ΔΨm) è associata con normale motilità e fertilizzazione alta capienza13. Al contrario, ΔΨm basso è associato con un livello elevato di specie reattive dell’ossigeno e ridotto tasso di fertilizzazione14. Tuttavia, vari composti ambientali, per esempio gli interferenti endocrini, possono indurre stress cellulare e portare a un aumento transitorio nel ΔΨm, hyperpolarization1,3, aumentata produzione di radicali liberi e, infine, apoptosi15. La sonda fluorescente 5, 5′, 6, 6′-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1) consente, ad esempio, esaminare gli effetti delle tossine di origine alimentare sul sperma ΔΨm1,3.
Spermiograms standard, basato su parametri fisiologici e morfologici, non sono abbastanza buone predire la qualità dello sperma. Metodi più accurati sono tenuti a garantire la qualità dello sperma. Qui, forniamo fattibile due metodi per determinare la qualità dello sperma sulla base delle valutazioni delle membrane degli spermatozoi: colorazione quadrupla simultanea con sonde fluorescenti specifiche e microscopia a fluorescenza, descritto nei nostri studi1,3 e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate, recentemente utilizzato nel nostro laboratorio e già utilizzato da altri16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Potenziale di fertilizzazione dello sperma dipende da molteplici fattori che riflettono la sua qualità. Un’alta concentrazione di spermatozoi e un’alta percentuale di spermatozoi mobili altamente progressivamente potrebbe essere considerati la qualità dello sperma. Tuttavia, tale valutazione non prendere in considerazione altri parametri cellulari e funzionali. L’uso di ‘Banco’ microcapillary citometro a flusso può essere facilmente adattato alla valutazione delle varie strutture di sperma usando sonde fluorescenti, c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare la società israeliana “SION” per inseminazione artificiale e l’allevamento (Hafetz Haim, Israele) per il loro aiuto e la cooperazione e la sig. ra Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Francia) per assistenza con la messa in funzione e la formazione.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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