Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע
Summary
כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.
Abstract
Spermiograms סטנדרטית המתארת איכות הזרע מתבססים בעיקר על הפרמטרים פיזיולוגיים וחזותית, כמו לפלוט נפח, ריכוז, תנועתיות, תנועתיות מתקדמת, ו זרע-מורפולוגיה הכדאיות. עם זאת, הערכות אלה לא מספיק טוב כדי לנבא את איכות הזרע. בהתחשב בכך תחזוקה של זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה תלוי הקרומיות ופונקציונליות תאיים, הערכה של פרמטרים אלה עשויות לאפשר חיזוי טוב יותר של מיומנות ההפריה של הזרע. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות האפשריים כדי להעריך את איכות הזרע שימוש ספציפי הגששים פלורסנט בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry ניתוחים. ניתוחים העריכו propidium יודיד (PI), הקרומיות acrosomal באמצעות fluorescein מצומדת isothiocyanate של קרום פלזמה תקינות באמצעות 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) אפון השדה agglutinin (FITC-PSA) ו מיטוכונדריאלי הקרומיות באמצעות 5, 5′, 6, 6′-טטרה-כלורו-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1). שילובים של שיטות אלה מוצגים. למשל, השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס). אנו מאמינים כי שיטות אלה, אשר מבוססים על בחינת ממברנות תא זרע, הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות הזרע.
Introduction
שלמות והפונקציונליות של ממברנות זרע הם כמה הגורמים המציין זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה. קרום פלזמה משמש כמחסום בין תאים תאיים, חוץ-תאית, ובכך שמירה על שיווי משקל osmotic הסלולר1. מתח שגורם נזק שלמות קרום פלזמה עלול לפגום הומאוסטזיס, תצמצם הקיבולת הכדאיות, הפריה ולהגדיל מוות של תאים. למשל, הקפאה קריוגנית מפחיתה את הכדאיות זרע עקב נזק שלה קרום פלזמה, עקב שינויי טמפרטורה ומתח osmotic2. בעבר דיווחנו כי חשיפת זרע בול ריכוזים נמוכים של והקאה מזהמים כגון מסוג אטרזין של חומרי הדברה, diaminochlorotriazine העיקריים המטבוליט שלה או את aflatoxin mycotoxin B1, מפחית את הזרע הכדאיות1,3 . זה נקבע על-ידי תיוג ה-DNA גדילי כפול עם דאפי בשילוב עם PI, אשר נקשר ה-DNA של תאים עם קרום פלזמה פגום.
תגובה acrosome (AR) כרוך פיוז’ן של קרום acrosome החיצוני של קרום פלזמה שמעליה וכתוצאה מכך שחרורו של אנזימים acrosomal4,5. אלה אירועים חיוני עבור חדירה zona-pellucida ומיזוג נוסף של הזרע עם oocyte6. לכן, הערכת הקרומיות acrosomal מהווה פרמטר שימושי כדי להעריך את איכות תאי הזרע ואת פוריות הגבר-7,–8,–9. מספר טכניקות פלורסנט מתאימים עבור אימות תקינות acrosome, FITC-הרשות הפלסטינית או FITC-PSA8,10. במחקרים קודמים שלנו, באמצעות דפוסי FITC-PSA מכתימים1,3, סיפק הגדרות מדויקות עבור (i) acrosome ללא פגע, (ii) פגום acrosome ממברנה ואנו (iii) הגיב acrosome. בדו ח הנוכחי, לנו להעריך את מצב acrosome באמצעות cytometry זרימה ייעודיים זרע ולהשוות את התוצאות לאלה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles מעורב ב, בין אחרים דברים, ATP סינתזה, ייצור מינים חמצן תגובתי, סידן איתות אפופטוזיס. תפקוד פיזיולוגי, כולל פוריות זכר ונקבה, הם קשורים פונקציה מיטוכונדריאלי שונה11. זרע המיטוכונדריה מסודרים של midpiece, לשחק תפקיד מכריע תנועתיות הזרע12. זה מקובל גם גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) מזוהה עם נורמלי תנועתיות הפריה גבוהה קיבולת13. לעומת זאת, ΔΨm נמוכה קשורה עם רמה גבוה של מינים חמצן תגובתי שומן מופחתת הפריה שיעור14. בכל זאת, תרכובות סביבתיים שונים, למשל האנדוקרינית משבשים, יכול לגרום מתח סלולארית, להוביל גידול ארעי של ΔΨm, hyperpolarization1,3, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים, בסופו של דבר. אפופטוזיס15. החללית פלורסנט 5, 5′, 6, 6′-טטרה-כלורו-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1) מאפשר בחינת לדוגמה, את ההשפעות של רעלים והקאה על זרע ΔΨm1,3.
Spermiograms סטנדרטי, בהתבסס על פרמטרים פיזיולוגיים, מורפולוגיים, אינם טובים מספיק לחזות ספירת זרע. שיטות מדויקות יותר נדרשים כדי להבטיח את איכות הזרע. כאן, אנו מספקים שתי שיטות האפשריים כדי לקבוע את איכות הזרע בהתבסס על הערכות של זרע ממברנות: צביעת מרובע בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תיאר ב שלנו מחקרים1,3 cytometry זרימה מתקדמות ייעודיים זרע, מנוצל לאחרונה המעבדה שלנו, כבר נמצא בשימוש על-ידי אחרים16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
פוטנציאל הפריה זרע תלויה בגורמים מרובים המשקף את איכותם. ריכוז גבוה של spermatozoa, שיעור גבוה של spermatozoa מאוד בהדרגה תאי עשוי להיחשב זרע באיכות גבוהה. למרות זאת, כזה הערכה לא לקחת בחשבון פרמטרים אחרים התאית ופונקציונליים. השימוש microcapillary ‘ספסל-top’ זרימת cytometer ניתן להתאים בקלות להערכה של מבנים זרע ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות “שיאון” חברה ישראלית עבור הזרעה והשבחה (חפץ-חיים, ישראל) על עזרתם שיתוף פעולה, ואת גברת Li Na (IMV טכנולוגיות, l ‘ aigle, צרפת) לקבלת סיוע עם כלי התקנה, הדרכה.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
