משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

Summary

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג’ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

Abstract

קיבעון של גנים על משטחים lithographically מובנה מאפשר המחקר של ג’ין ממודר ביטוי תהליכים במערכת ביוריאקטור microfluidic פתוח. בניגוד גישות אחרות כלפי מערכות סלולריות מלאכותי, כזו מלכודת מאפשר אספקה רציפה עם ריאגנטים ביטוי גנים וניקוז סימולטני של חומרי פסולת. זה מקל על ביצוע תהליכי ביטוי הגן ללא תא במשך תקופות זמן, וזה חשוב עבור מימוש מערכות משוב רגולטוריות ג’ין דינמי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט הזיוף של biochips גנטי בטכניקה פשוטה לשימוש ליטוגרפית בהתבסס על DNA סטרנד תגובות הדחק, המשתמשת אך ורק רכיבים זמינים מסחרית. אנו מספקים גם פרוטוקול על האינטגרציה של גנים ממודר polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic מערכת מבוססת. יתר על כן, אנו מראים כי המערכת הוא תואם עם מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF), אשר יכול לשמש בהתבוננות ישירה של אינטראקציות מולקולרי בין DNA מולקולות הכלול המיקס ביטוי.

Introduction

תא-ביטוי גנים תגובות הן עניין רב ליישומים שונים, ביוכימיה, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית חינם. תא ללא ביטוי של חלבונים היה אינסטרומנטלי עבור הכנת דגימות חלבון טהור, אשר היו בסיס מחקרים רבים בביולוגיה מבנית. למשל, מערכות ללא תא בהצלחה שימשו עבור הביטוי של חלבון מתחמי¹ או קרום חלבונים², אשר הם קשה לייצר שימוש בביטוי מבוססת-תא. ראוי לציין, התא ללא ביטוי גנים תגובות שימשו גם להבהיר את המבנה של הקוד הגנטי, החל הניסויים פורצי דרך על-ידי נירנברג Matthaei 1961³.

לאחרונה, יש כבר עניין מחודש בשיטות ללא תאים, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית-^4,–^5,–⁶. מערכות ללא תא ניתן בתוספת עם תרכובות הלא-ביולוגיים, רכיבים מגוונים ממקור ביולוגי ניתן לשלב בקלות רבה יותר⁷. אף-על-פי מערכות ללא תא יש החיסרון לכאורה הם אינם “גדלים ומתחלקים”, זה מתקבל על הדעת להכין ריאקטורים ללא תא פתוח עם פונקציות בסיסיות מטבולית ולתת להם לסנתז מטבוליטים כאשר מסופק עם פחמן פשוטה ואנרגיה תשומות⁸. בתוך השדה המתעוררים של ביולוגיה סינתטית, מערכות ללא תא מבטיחה להיות צפוי יותר “מארז” ליישום של תפקודים ביולוגיים סינתטי.

כיום, ללא תא ג’ין ביטוי תגובות מבוצעות או באמצעות תא תמציות (ממקורות שונים כגון חיידקים, שמרים, חרקים), או מערכות תרגום/תמלול אשר היו אופטימיזציה עבור יישומים שונים (למשל, prokaryotic לעומת האיקריוטים ביטוי גנים, הפקה של חלבוני ממברנה, וכו ‘). פרוטוקול פופולרי עבור הכנת תמצית תא החיידק (הפטרוני TXTL) סופק לאחרונה על ידי Noireaux (פ’) ועמיתים⁹. תכונותיו biophysical מאופיין ביסודיות¹⁰, מערכת TXTL כבר שימש בהצלחה לבצע סדרה של משימות מורכבות הביוכימי: למשל, ההרכבה של bacteriophages פונקציונלי ויה תא ללא ביטוי של הגנום phage¹¹, הסינתזה של חלבון חיידקי חוטים¹²או היישום של הגן ללא תא מעגלים^13,14.

מערכת אחרת מבוקש ב ביולוגיה סינתטית ללא תא היא מערכת טהור, אשר הוא מחדש של רכיבי מטוהרים^15,16. בהשוואה למערכת TXTL, הוא אינו מכיל nucleases או חלבון השפלה מכונות. תוך השפלה של DNA ליניארי, מולקולות RNA או חלבונים הוא פחות בעיה במערכת טהור, מסלולים עששת חשובים למעשה עבור מימוש פונקציות דינמיות. כדי להפחית את האפקט של אקסונוקלאז השפלה של ג’ין ליניארי תבניות למערכת TXTL (דרך RecBCD), החלבון GamS הגנה על קצה צריך להתווסף. גם את TXTL וגם מערכת טהור זמינים מסחרית.

נושא קשור קשר הדוק ל ביולוגיה תא ללא דאגות המחקר של ההשפעה של מידור על תגובות ביוכימיות, נוסף על הקמת מבנים דמויי-תא מלאכותיים או protocells^{17,18,19 ,20}. מחקר על תאים מלאכותיים כוללת בדרך כלל את ומגעים מערכת התגובה הביו בתוך תאי vesicular זני פוספוליפידים או חומרים פעילי שטח אחרים. בעוד מערכות כאלה לעזור לחקור את ההיבטים הבסיסיים של מידור, או הופעתה של cellularity ומבנים המשכפלת, הם עומדים בפני בעיות טיפוסיות של מערכות סגורות: בהיעדר של מטבוליזם של תפקוד והולמים מנגנוני הובלה ממברנה, קשה לשמור על תגובות ממודר פועל במשך פרקי זמן ארוכים – מולקולות הדלק משמשים ולצבור הפסולת.

אלטרנטיבה מעניינת מידור בתוך תאים מחקה תא כזה הוא הארגון המרחבי של חומר גנטי בשיטות photolithographic. קיבעון של “גנים על שבב” היה חלוץ על ידי קבוצת בר-זיו במכון ויצמן לפני יותר מעשר שנים²¹. בין הנושאים העיקריים היו צריכים להיפתר היו של ספיחה שאינם ספציפיים של ה-DNA, את פוטנציאל דנטורציה של חלבונים על פני שבב. . בר-זיו ואח פיתח להתנגד פוטוליתוגרפיה ייעודי כינה “דייזי”, אשר היה מורכב silane מסוף תגובתי על הנייח של מולקולות להתנגד על משטחים צורן דו-חמצני, כרווח ארוך פוליאתילן גליקול (PEG) זה מובטח הביו, headgroup photocleavable, אשר הוסב על אמין תגובתי על הקרנה עם אור אולטרה סגול (UV). הוכח כי דייזי יכול לשמש כדי לשתק גנים באורך במולקולות דנ א (באורכים של קילו מספר בסיסי-זוגות (kbp)) על משטח השבב. פולימר פיזיקה נקודת מבט, ייצג המערכות מברשות פולימר הושתל על גבי מצע מוצק. בשל אופיו polyelectrolyte של ה-DNA, שיאשר מברשות אלה מושפע בחוזקה תופעות ספציפיות יון ואחרים^22,23.

והכי חשוב, זה הוכח כי הגנים המצע. מרותק למיטה עדיין מתפקד, יכולים להיות משועתקים, תרגום לתוך RNA וחלבון. ג’ין מברשות נגישים עבור ה-RNA polymerases מ פתרון²⁴, לא שפגע בסימני את התערובת macromolecular תרגום/תמלול על פני השטח. אחד היתרונות של קיבעון של רכיבים גנטיים על מצע הוא כי הם יכול להיות מופעל בכל מערכת הכור microfluidic פתוח ברציפות המסופק עם מולקולות קטנות קודמן ומן אילו מוצרים פסולת יכול להיות שהוסרו^{25 , 26}.

לאחרונה פיתחנו וריאציה של שיטה זו כינה Bephore (עבור קרינה מסתיימים ו photoresist)²⁷, אשר היה מבוסס באופן בלעדי על רכיבים זמינים מסחרית, מנוצל ספציפיים רצף DNA סטרנד הפלישה תגובות עבור מימוש הליך ליתוגרפיה שקודמים פשוטה כדי ליישם את הקמת מבוססי שבב תאים מלאכותיים. מבט סכמטי של התהליך מוצג באיור1. הוא מבוסס על מולקולות דנ א סיכת ראש המכיל קבוצת photocleavable, אשר נמצאים ותשמרו על שכבה פג מסתיימים. Photocleavage של הסיכה חושף רצף מקום אחיזה לרגל חד-גדילי, דרך איזה DNA מולקולות עניין (המכיל את רצף דיס “והותירו”) יכול להיות המחוברים באמצעות גדיל בתיווך מקום אחיזה לרגל הפלישה.

בעוד Bephore הוא שעשוי להיות פשוט ליישם, דייזי מאפשר את מימוש מאוד צפוף ונקי “ג’ין מברשות”, אשר יש יתרונות ביישומים מסוימים. עקרונית, עם זאת, ליתוגרפיה Bephore ודייזי יכולים לשלב בקלות. שיטת ליתוגרפיה קשורים ניצול DNA הזחה סטרנד להבניית DNA מברשות על זהב קודם לכן פותחה על ידי הואנג. et al., אך היה מנוצל לא בהקשר של הגן ללא תא ביטוי^28,29.

בפרוטוקול הבא אנו מספקים שתיאור מפורט של הייצור של ה-DNA מברשות על ביטוי גנים תא ללא שימוש בשיטת Bephore. אנו מתארים כיצד האסימונים ג’ין מיוצרים, מדגימים את השימוש רב שלבי פוטוליתוגרפיה לאימוביליזציה במרחב מובנית של גנים על שבב. נדון גם הזיוף של תגובת תאי והיישום של מיקרופלואידיקה להופעה של ג’ין על שבב ביטוי תגובות.

Protocol

הערה: לוח זמנים עבור השלבים בסעיפים שונים הוא נתון המידע הנוסף (סעיף 1). 1. שבב פבריקציה נוספת הערה: כמו מצעים, שימוש סיליקון (קוטר 100 מ מ, 0.525 מ מ עובי) עם 50 ננומטר שכבה עבה של צורן דו-חמצני או שקופיות זכוכית (24 מ מ x 24 מ מ, 1.5 מס; 22 מ מ x 50 מ מ, מס ‘ 4.). בהתאם ליישום, בעוביים ו?…

Representative Results

ליתוגרפיה בשני שלבים: איור 5 מראה התוצאה של תהליך בן שני שלבים ליטוגרפיה על משטח זכוכית עם דפוסים של גדילי דיס fluorescently שכותרתו חופפים. הביטוי של חלבון פלואורסצנטי של מברשת ג’ין: איור 6 מדגים את הביטוי של החלב…

Discussion

ליתוגרפיה Bephore היא טכניקה חזקה ופסיביות לאימוביליזציה עם תבנית ה-DNA או RNA. ובכל זאת, הפרוצדורה כוללת מספר שלבים אשר – אם משתנה – עשוי להיות מקור לכישלון או מופחתת הביצועים של המערכת.

שלב חיוני בייצור שבבי Bephore הוא PEGylation של המצע, אשר מספק את התאימות של פני השטח. . הנה, הצעד ניקוי עם…

Materials

Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4	Menzel		22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5	Assistent		24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane	Laysan Bio		MW 5,000
Anhydrous toluene	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Streptavidin	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281	Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	Cell-free expression system
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	micro resist technology GmbH		Photoresist
mr-Dev 600	micro resist technology GmbH		Photoresist developer
Ti-Prime	MicroChemicals		Adhesion promoter
Two-component silicon glue	Picodent	Twinsil
UV-protection yellow foil	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
Equipment
Masks for photolithography	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180×240 mm
Upright microscope	Olympus	BX51	Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera	Photometrics	Coolsnap HQ	Used with Olympus BX51
Ligtht source	EXFO	X-Cite 120Q	Used with Olympus BX51
Inverted microscope	Nikon	Ti2-E	Fluorescence imaging of gene expression
4x objective	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Used with Nikon Ti2-E
Camera	Andor	Neo5.5	Used with Nikon Ti2-E
Light source	Lumencor	SOLA SM II	Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator	Okolab	bold line	Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller	Elveflow	OB1 MK3
NanoPhotometer	Implen		DNA concentration measurement
Plasma cleaner	Diener	Femto	200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage