Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia
Summary
Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.
Abstract
Imobilização de genes em superfícies Litograficamente estruturadas permite o estudo do gene compartimentada processos de expressão em um sistema do biorreator microfluidic aberto. Em contraste com outras abordagens para sistemas celulares artificiais, tal uma configuração permite um fornecimento contínuo com reagentes de expressão de gene e drenagem simultânea de produtos residuais. Isto facilita a implementação de processos de expressão do gene sem célula durante longos períodos de tempo, o que é importante para a realização de sistemas de feedback reguladoras do gene dinâmico. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a fabricação de biochips genéticas usando uma simples de usar litográfica técnica baseada em reações de deslocamento do DNA strand, que usa exclusivamente componentes disponíveis comercialmente. Também oferecemos um protocolo sobre a integração dos genes compartimentadas com um polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic sistema baseado. Além disso, mostramos que o sistema é compatível com microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total, que pode ser usada para a observação direta de interações moleculares entre o DNA e as moléculas contidas na mistura, a expressão.
Introduction
Célula-liberdade de expressão de gene reações são de grande interesse para várias aplicações de biotecnologia, bioquímica e biologia sintética. Célula-livre expressão de proteínas foi fundamental para a preparação de amostras de proteína pura, que serviram de base para inúmeros estudos em biologia estrutural. Por exemplo, sistemas de célula livre foram usados com sucesso para a expressão da proteína complexos1 ou membrana proteínas2, que são difíceis de produzir usando a expressão baseada em célula. Notavelmente, célula livre expressão gênica reações também foram utilizadas para elucidar a estrutura do código genético, começando com os inovadoras experimentos por Nirenberg e Matthaei em 19613.
Recentemente, tem havido um interesse renovado em métodos sem célula em biotecnologia e biologia sintética4,5,6. Sistemas sem célula podem ser aumentados com compostos não-biológico, e componentes de origem biológica diversa podem ser combinadas mais facilmente7. Apesar de sistemas sem célula têm a desvantagem aparente que eles não fazem “crescer e se dividir”, é concebível para preparar aberto sem célula biorreatores com funções metabólicas básicas e deixá-los a sintetizar metabólitos quando fornecido com energia e carbono simples entradas8. Dentro o campo emergente da biologia sintética, sistemas sem célula prometem ser um “chassis” mais previsível para a implementação de funções biológicas sintéticas.
Atualmente, as reações de expressão do gene sem célula são realizadas utilizando célula extrai (a partir de diferentes fontes tais como bactérias, leveduras, insetos), ou sistemas de transcrição e tradução que foram otimizados para diferentes aplicações (por exemplo, procariotas vs eucariotas expressão gênica, produção de proteínas de membrana, etc.). Um protocolo popular para a preparação do extrato de célula bacteriana (comumente denominado TXTL) foi fornecido recentemente por V. Noireaux e colegas de trabalho9. Suas propriedades biofísicas tem sido completamente caracterizadas10, e o sistema TXTL foi já utilizado com sucesso para realizar uma série de tarefas bioquímicas complexas: por exemplo, o assembly de bacteriófagos funcional através de célula-livre expressão do genoma do fago11, a síntese de proteínas bacterianas filamentos12ou a implementação de circuitos de gene sem célula13,14.
Popular em biologia sintética sem célula outro sistema é o sistema puro, que é reconstituído a partir de componentes purificados15,16. Em comparação com o sistema TXTL, ele não contém nucleases ou máquinas de degradação de proteínas. Enquanto a degradação do DNA linear, moléculas de RNA ou proteínas é menos de um problema do puro sistema, caminhos de decaimento são realmente importantes para a implementação de funções dinâmicas. Para reduzir o efeito de degradação do exonuclease de modelos lineares gene no sistema TXTL (por RecBCD), a proteína de GamS extremidade-proteger tem a ser adicionado. Tanto o TXTL e o sistema puro estão comercialmente disponíveis.
Um tema intimamente relacionado às preocupações de biologia celular-free o estudo do efeito da compartimentalização em reações bioquímicas e ainda mais a criação de estruturas artificiais célula ou protocélulas17,18,19 ,20. Pesquisa sobre células artificiais normalmente envolve o encapsulamento de um sistema de reação bioquímica dentro de compartimentos vesiculares de fosfolipídios ou outros amphiphiles. Enquanto tais sistemas ajudam a explorar os aspectos fundamentais da compartimentalização, ou o surgimento de celularidade e estruturas auto-replicante, que enfrentam os problemas típicos de sistemas fechados: na ausência de um metabolismo funcional e apropriado mecanismos de transporte de membrana, é difícil manter reações compartimentadas correndo por longos períodos de tempo – usadas de moléculas de combustível e produtos de resíduos se acumulam.
Uma alternativa interessante para compartimentalização dentro desses compartimentos celulares-imitando é a organização espacial do material genético usando métodos fotolitográfica. Imobilização de “genes em um chip” foi pioneira pelo grupo no Instituto Weizmann de Bar-Ziv há mais de dez anos21. Entre as principais questões que precisavam ser resolvidos foram a adsorção não específica de DNA e a potencial desnaturação das proteínas na superfície do chip. Bar-Ziv et al desenvolveram um resist fotolitografia dedicado denominado “Daisy”, que era composto de um silano reativo terminal para a imobilização das moléculas sobre superfícies de dióxido de silício, resiste um espaçador de longa polietileno glicol (PEG) que assegurou biocompatibilidade e uma headgroup photocleavable, que foi convertido em uma amina reativa após irradiação com luz ultravioleta (UV). Ficou demonstrado que a Daisy pode ser usado para imobilizar a moléculas de DNA do gene-comprimento (com comprimentos de vários quilo-pares de bases (kbp)) sobre uma superfície de chip. Polímero física ponto de vista, os sistemas representaram escovas de polímero enxertadas em um substrato sólido. Devido à natureza do polyelectrolyte do DNA, a conformação dessas escovas é fortemente afetada pela osmótica e outros efeitos íon-específicos de22,23.
O mais importante, ficou demonstrado que genes de substrato-imobilizado são ainda funcionais e podem ser transcrita e traduzida para o RNA e proteína. Escovas do gene são acessíveis para ARN-polimerase de solução24, e a mistura complexa macromolecular da transcrição/tradução não é desnaturada na superfície. Uma das vantagens da imobilização dos componentes genéticos sobre um substrato é que podem ser operados em um sistema de reator aberto microfluidic continuamente fornecido com moléculas precursoras pequenas e de produtos que resíduos podem ser removidos25 , 26.
Recentemente desenvolvemos uma variante desse método denominado Bephore (para o feixe de elétrons biocompatível e fotorresiste)27, que foi baseado exclusivamente em componentes disponíveis comercialmente e utilizadas sequência-DNA strand invasão a reacções específicas para a realização de um procedimento simples para implementar várias etapas litografia para a criação de células artificiais baseada no chip. Uma visão esquemática do processo é mostrada na Figura 1. É baseado no gancho de cabelo as moléculas de DNA que contém um grupo de photocleavable, que são imobilizadas em uma camada de PEG biocompatível. Photocleavage do gancho de cabelo apresenta uma sequência de single-stranded ponto de apoio, através do qual DNA moléculas de interesse (que contém a sequência DIS “uma substituição”) podem ser anexado através de invasão de vertente mediada por ponto de apoio.
Enquanto Bephore é potencialmente mais simples de implementar, Daisy permite a realização de muito denso e limpo “gene” pincéis, que tem vantagens em certas aplicações. Em princípio, no entanto, litografia de Daisy e Bephore poderia ser facilmente combinada. Um método de litografia relacionada utilizando escovas de deslocamento de strand DNA para estruturação do DNA em ouro foi desenvolvido anteriormente por Huang et al, mas não foi utilizado no contexto da expressão de gene sem célula28,29.
O protocolo seguinte nós fornecemos que uma descrição detalhada da produção de DNA brushes para expressão do gene sem célula usando o método Bephore. Descrevemos como os chips de gene são fabricados e demonstram o uso de foto-litografia de várias etapa para a imobilização espacialmente estruturada dos genes em um chip. Discutimos também a fabricação de câmaras de reação e a aplicação de microfluídica para o desempenho das reações de expressão do gene em-microplaqueta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Litografia de Bephore é uma técnica robusta e versátil para a imobilização padronizada de DNA ou RNA. Ainda, o procedimento inclui várias etapas, que – se alterado – podem ser uma fonte para falha ou reduzir o desempenho do sistema.
Um passo crucial na fabricação de chips de Bephore é a PEGylation do substrato, que fornece a biocompatibilidade da superfície. Aqui, a etapa de limpeza com um procedimento RCA é importante, desde que ele também ativa a superfície para a silanização …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Com gratidão reconhecemos o apoio financeiro para este projeto, a Volkswagen Stiftung (grant, n. º 883 de 89) e o Conselho Europeu de investigação (concessão acordo n. º 694410 – AEDNA). M.S.-S. reconhece o apoio pelo DFG através de Silvina 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
