Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon
Summary
Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.
Abstract
Lithographically yapısal yüzeylerde genlerin immobilizasyon compartmentalized gen çalışmanın bir açık mikrosıvısal biyoreaktör sisteminde ifade işlemleri sağlar. Yapay hücresel sistemleri diğer yaklaşımlar aksine, gen ifade reaktifler ve atık ürünlerin eşzamanlı boşaltma ile sürekli bir tedarik için böyle bir kurulum sağlar. Bu boş hücre gen ifade işlemleri uygulama uzun bir süre dinamik gen düzenleyici görüş sistemleri gerçekleşmesi için önemli olan, üzerinde kolaylaştırır. Burada sadece ticari olarak mevcut bileşenleri kullanan DNA strand yer değiştirme reaksiyonları üzerinde dayalı bir basit-e doğru-kullanma tekniğinde tekniği kullanarak genetik biochips imalatı için detaylı bir protokol sağlar. Biz aynı zamanda bir polydimethylsiloxane (PDMS) bölümlere genler entegrasyonu üzerinde bir protokol sağlar-tabanlı mikrosıvısal sistemi. Ayrıca, sistem doğrudan gözlem DNA ve ifade karışımda bulunan moleküller arasındaki moleküler etkileşim için kullanılan toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi ile uyumlu olduğunu göstereceğiz.
Introduction
Hücre-alerjik reaksiyonlar Biyokimya, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji çeşitli uygulamalar için yoğun ilgi vardır gen ekspresyonu. Boş hücre ifade proteinlerin çok sayıda çalışma için temel yapısal biyoloji dersinde olduğunu saf protein örnekleri hazırlanması için vesile oldu. Örneğin, boş hücre sistemleri hücre tabanlı ifade kullanarak üretmek zor olan protein kompleksleri1 veya membran proteinleri2, ifade için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Özellikle, hücre ücretsiz-gen ekspresyonu reaksiyonlar da 19613çığır açan deneylerde Nirenberg ve Matthaei ile başlayan genetik kod yapısını aydınlatmak için kullanıldı.
Son zamanlarda, boş hücre Yöntemler Biyoteknoloji ve sentetik biyoloji4,5,6yenilenmiş bir ilgi olmuştur. Boş hücre sistemleri biyolojik olmayan bileşikler ile artar ve bileşenleri çeşitli biyolojik kökenli daha kolay7birleştirilebilir. Boş hücre sistemleri onlar “büyümek ve bölmek” yapmak değil bariz dezavantajı olsa bile, bu temel metabolik fonksiyonları ile açık boş hücre Biyoreaktörler hazırlamak ve onlara sağlanan basit karbon ve enerji ile metabolitleri sentezlemek için akla yatkın girişleri8. Sentetik biyoloji gelişmekte olan alanı içinde boş hücre sistemleri bir daha öngörülebilir “kasa” uygulanması için sentetik biyolojik fonksiyonların olacağıma söz veriyorum.
Şu anda, boş hücre gen ifade tepkiler are ikisinden biri istimal dışarı araba hücre ayıklar (farklı kaynaklardan gelen bakteri, Maya, böcekler gibi), veya (Örneğin, farklı uygulamalar için en iyi duruma getirilmiş transkripsiyon/çeviri sistemleri prokaryotik ve Ökaryotik gen ekspresyonu, üretim zar proteinleri, vb). Yaygın bir iletişim kuralı (yaygın olarak adlandırdığı TXTL) bakteri hücre özü hazırlanması için son zamanlarda V. Noireaux ve iş arkadaşlarınızla9tarafından sağlandı. Biyofiziksel özellikleri iyice karakterize10edilmiş ve TXTL sistem zaten başarılı bir şekilde karmaşık biyokimyasal görevleri bir dizi yapmak için kullanılmıştır: Örneğin, fonksiyonel bacteriophages yolu ile Meclisi Feyc genom11, bakteriyel protein filamentler12sentezi veya boş hücre gen devreleri13,14uygulamaları ifade boş hücre.
Başka bir sistem içinde boş hücre sentetik biyoloji popüler saf bileşenleri15,16‘ dan yeniden saf sistemidir. TXTL sisteme göre enzimler veya protein yıkımı makine içermez. Doğrusal DNA bozulması, RNA molekülleri proteinler mi bir sorun daha az saf sisteminde, çürüme yolları aslında dinamik işlevleri uygulanması için önemlidir. TXTL sistemi (RecBCD) aracılığıyla doğrusal gen şablonları eksonükleaz bozulma etkisini azaltmak için eklenecek son koruma GamS protein vardır. TXTL ve saf sistemi ticari olarak kullanılabilir.
Bir tema yakından boş hücre biyolojisi kaygıları bölünebilme biyokimyasal reaksiyonlar üzerinde etkisi ve daha fazla yapay hücre benzeri yapıları veya protocells17,18,19 oluşturma çalışma ilgili. ,20. Araştırma yapay hücrelerde genellikle veziküler bölmeleri fosfolipitler veya diğer amphiphiles yapılmış içinde bir biyokimyasal reaksiyon sistemi encapsulation içerir. Bu tür sistemlere bölünebilme temel yönlerini veya cellularity ve kendi kendini kopyalayan yapıları keşfetmek için yardımcı olsa da, onlar kapalı sistemler tipik sorunlarla karşı karşıya: yokluğunda işleyen bir metabolizma ve uygun membran taşıma mekanizmaları, bu bölümlere tepkiler uzun bir süre için çalışan tutmak zordur – yakıt molekülleri kullanılır ve atıklar birikir.
Bölünebilme böyle hücre taklit eden bölmeleri içinde için ilginç bir alternatif genetik materyal photolithographic yöntemlerle uzamsal kuruluştur. İmmobilizasyon “genlerin bir yonga üzerinde” on yıldan fazla öncülük Weizmann Enstitüsü Bar-Ziv grubu tarafından21. Çözülmesi gereken önemli konular arasında belirsiz adsorpsiyon DNA ve proteinler çip yüzeyinde potansiyel denatürasyon idi. Bar-Ziv vd immobilizasyon silikon dioksit yüzeylerde resist moleküllerin emin uzun Polietilen glikol (PEG) ayırıcı için reaktif bir terminal silane oluşan “Daisy” olarak adlandırdığı bir adanmış fotolitografi resist geliştirilen biyouyumluluk ve ışınlama ultraviyole (UV) ışık ile üzerine bir reaktif Amin içine dönüştürülmüş bir photocleavable headgroup. Daisy bir çip yüzeyinde (ile birkaç kilo baz-çifti (kbp) uzunlukları) gen-uzunluk DNA molekülleri hareketsiz için kullanılabilir gösterilmiştir. Bir polimer fizik açısından bakıldığında, bir katı substrat aşılı polimer fırçalar sistemleri temsil. DNA Polielektrolit yapısı nedeniyle bu fırçaların uyum kuvvetle ozmotik ve diğer iyon özel efektleri22,23tarafından etkilenir.
En önemlisi, substrat immobilize genleri hala işlevsel ve kopya etmek ve içine çevrilmiş RNA ve protein olabilir gösterilmiştir. Gene fırçalar için RNA polimeraz çözüm24erişilebilir ve transkripsiyon/çeviri karmaşık makromoleküllerin karışımı yüzeyde denatüre değil. Onlar sürekli olarak küçük habercisi moleküller ile ve hangi atık ürünlerin kaldırılan25 olabilir üzerinden sağlanan bir açık mikrosıvısal reaktör sisteminde çalıştırılabilir immobilizasyon bir yüzey üzerinde genetik bileşenlerinin avantajlarından biri olduğunu , 26.
Biz son zamanlarda sadece ticari olarak mevcut bileşenleri dayanıyordu ve fingerprinting DNA strand işgaline tepkiler için kullanılan Bephore (için biyouyumlu elektron ışını ve fotorezist)27, olarak adlandırılan bu yöntem bir türevi geliştirilmiştir yapay hücre çip tabanlı oluşturulması için bir basit uygulamak multistep litografi yordam gerçekleştirilmesi. Yordamı şematik bir bakış Şekil 1‘ de gösterilen. Biyouyumlu PEG katman üzerinde immobilize photocleavable grubu içeren DNA saç tokası molekülleri dayanır. Photocleavage saç tokası, hangi DNA yoluyla bağlı yolu ile çıkıntı aracılı strand işgali molekülleri (“yerinden” DIS sıra içeren) ilgi olabilir bir tek iplikçikli çıkıntı dizisi sunar.
Bephore uygulamak potansiyel olarak daha basit olmakla birlikte, Daisy çok yoğun ve temiz gerçekleştirilmesinin sağlar “gen fırçalar”, hangi belirli uygulamalarda avantajları vardır. Prensip olarak, ancak, Daisy ve Bephore litografi kolayca birlikte. DNA iplikçik deplasman DNA yapılanma için altın fırçalar kullanan bir ilgili litografi yöntemi daha önce Huang vdtarafından geliştirilmiş, ancak boş hücre gen ifade28,29bağlamında kullanılmıştır değil.
Aşağıdaki protokolünde DNA üretim ayrıntılı bir açıklaması için Bephore yöntemini kullanarak boş hücre gen ekspresyonu fırçaları sağlar. Biz nasıl gen cips cihazlarında ve genlerin bir yonga üzerinde dağınık şekilde yapılandırılmış immobilizasyon için çok adımlı fotoğraf-litografi kullanımını göstermek açıklanmaktadır. Biz de tepki odaları imalatı ve havacilik üstünde-küçük parça gen ifade reaksiyonlar performansı için uygulama tartışıyorlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore litografi DNA veya RNA desenli immobilizasyon için güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Henüz, yordam olan – çevirdiyseniz – başarısızlık için bir kaynak bulabilirsiniz birkaç adım içerir veya sistemin performansı düşer.
Bephore cips imalatı bir çok önemli biyouyumluluk yüzey sağlar substrat PEGylation adımdır. Ayrıca sonraki silanization için yüzey aktive beri burada, bir RCA yordamı ile temizlik adım önemlidir. Gerçek PEGylation sırasında belgili tan?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Volkswagen Vakfı (grant no. 89 883) ve Avrupa Araştırma Konseyi (Hibe Sözleşmesi No 694410 – AEDNA) tarafından bu proje için finansal destek minnetle anıyoruz. YÜKSEK LİSANS-S. Destek DFG GRK 2062 aracılığıyla tarafından kabul eder.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
