Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus
Summary
Der Locus Coeruleus ist eine kleine Ansammlung von Nervenzellen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Maus Gehirn Abschnitte auf das Studium der Proteine und Metalle in diesem Kern vorzubereiten.
Abstract
Der Locus Coeruleus (LC) ist ein bedeutender Knotenpunkt von Noradrenalin produzierenden Neuronen, die eine Reihe von physiologischen Funktionen zu modulieren. Strukturelle oder funktionelle Anomalien der LC Einfluss auf verschiedene Gehirnregionen einschließlich Kortex, Hippocampus und Kleinhirn und können dazu beitragen, Depressionen, bipolare Störungen, Angst, sowie Morbus Parkinson und Alzheimer-Krankheit. Diese Erkrankungen sind häufig mit Metall Ungleichgewichtigkeit verbunden, aber die Rolle der Metalle in LC ist nur teilweise verstanden. Morphologische und funktionelle Studien von LC sind erforderlich, um besser zu verstehen, die menschliche Pathologien und den Beitrag von Metallen. Mäuse sind ein weit verbreitetes experimentelles Modell, aber die Maus LC ist klein (~0.3 mm Durchmesser) und schwer zu erkennen, für nicht-Experten. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt Immunohistochemistry-basiertes Protokoll um die LC im Gehirn Maus zu lokalisieren. Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), und Alternativ Tyrosin Hydroxylase (TH), beide Enzyme, die hoch in den LC ausgedrückt werden als immunhistochemischen Marker in Hirnschnitten verwendet. Abschnitte neben LC-haltigen Abschnitte können zur weiteren Analyse, einschließlich Histologie für morphologische Studien, Ergospirometrie, sowie Metall-Bildgebung von Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM) verwendet werden.
Introduction
Der Locus Coeruleus (LC) ist eine wichtige Region im Hirnstamm und ein wichtiger Standort von Noradrenalin (NE) Produktion1. Die LC sendet Projektionen im gesamten Gehirn2 an den Kortex, Hippocampus und dem Kleinhirn3 und regelt wichtige physiologische Prozesse, einschließlich zirkadianen Rhythmus4,5, Aufmerksamkeit und Gedächtnis6, betonen Sie7, kognitive Prozesse8und Emotion9,10. Dysfunktion des LC hat in neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen11, darunter Parkinson Krankheit12,13,14, Alzheimer-Krankheit14, Depression15 verwickelt ,16,17, bipolare Störung18,19und Angst20,21,22,23, 24. Angesichts dieser Rollen, Analyse der LC ist entscheidend für seine Funktion und Dysfunktion zu studieren.
Mäuse sind für Untersuchungen physiologische und pathophysiologische Prozesse verbreitet. Aufgrund ihrer geringen Größe hat die Maus LC einen Durchmesser von ~ 300 μm, was zu Schwierigkeiten Auffinden der Struktur. Im Gehirn zu schneiden, kann LC im koronalen oder sagittale Abschnitte leicht übersehen werden. Verfügbare Studien beschreiben, Identifizierung von LC bei Tieren bieten kein Schritt für Schritt-Protokoll, dass ein nicht-Experte,1,25folgen kann. Also, um Leitlinien für die Lokalisierung von LC anbieten zu können, beschreiben wir eine Protokoll, die wir entwickelt, um diese Region im Gehirn Maus für mehrere Anwendungen (Abbildung 1, Abbildung 2, , Abbildung 3) zu finden. Das Protokoll gilt sorgfältig kontrollierten Gehirn-Schnitt und immunhistochemische Nachweis von DBH26,27, alternativ TH24, beide Enzyme hochangereichertes in der LC-28. Sobald LC von Immunohistochemistry befindet, können benachbarte Gehirnscheiben für weitere Studien, einschließlich der morphologischen und metabolische Analysen sowie Metall bildgebenden Studien über Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM)29verwendet werden. Wir beschreiben XFM als Vorbild in diesem Protokoll (Abbildung 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Richtig ausrichten der Probekörpers ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwendest, um LC (Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigen Colliculus) zu finden, ist es wichtig, dass die Teile richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei richtig einstellen das Gehirn in die Maus Gehirn Schneidemaschine Matrix. Es wird empfohlen, ~ 500 μm mehr Gewebe schneiden, Front- und Seitenzahnbereich, LC zu vermeiden, den Zellkern fehlt. Der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Abigael Muchenditsi für die Wartung der Maus Kolonie. Verwendung von Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory wurde unterstützt von der US-Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften, unter Vertragsnummer: DE-AC02-06CH11357. Wir danken Olga Antipova und Dr. Stefan Vogt für User-Support und Unterstützung bei der Advanced Photon Source. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant 2R01GM101502 SL finanziert.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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