Fare beynindeki Locus Coeruleus lokalizasyonu
Summary
Locus coeruleus nöronlar fizyolojik süreçleri çeşitli ilgili küçük bir kümesidir. Burada, biz fare beyin bölümleri çalışmalar proteinler ve bu çekirdek metal analizleri hazırlamak için bir protokol tanımlamak.
Abstract
Locus coeruleus (LC) fizyolojik fonksiyonları bir dizi modüle nöronlar üreten norepinefrin önemli bir merkezidir. LC yapısal veya fonksiyonel anormallikleri korteks, Hipokampus ve beyincik de dahil olmak üzere çeşitli beyin bölgeleri etkileyen ve depresyon, bipolar bozukluk, anksiyete, hem de Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı için katkıda bulunabilir. Bu bozuklukların genellikle metal dengesizliğe ile ilişkili, ama metaller LC rolü yalnızca kısmen anlaşılmaktadır. Akkreditivin morfolojik ve fonksiyonel çalışmalar insan patolojiler ve metaller katkısını daha iyi anlamak için ihtiyaç vardır. Fareler yaygın olarak kullanılan bir deneysel model, ancak fare LC küçük (~0.3 mm çap) ve sigara bir uzman için tanımlamak zor. Burada, biz fare beynindeki LC yerelleştirmek için adım adım bir immünhistokimya tabanlı protokol tanımlamak. Dopamin-β-hidroksilaz (DBH) ve alternatif olarak, tirozin hidroksilaz (TH), son derece LC ifade edilen her iki enzim immunohistokimyasal işaretleyicilerini beyin dilimler olarak kullanılır. LC içeren bölümler için bitişik bölümleri Histoloji morfolojik araştırmalar, metabolik test, hem de metal görüntüleme için de dahil olmak üzere daha fazla analiz, x-ışını Floresans mikroskobu (XFM) tarafından kullanılabilir.
Introduction
Locus coeruleus (LC) beyin sapı ve norepinefrin (NE) üretim1büyük bir sitenin önemli bir ülkedir. LC korteks, Hipokampus ve beyincik3 projeksiyonlar beyin2 boyunca gönderir ve sirkadiyen ritim4,5, dikkat ve bellek6dahil olmak üzere önemli fizyolojik süreçleri düzenler, 7, Bilişsel süreçler8ve duygu9,10stres. Disfonksiyon Akkreditivin Parkinson hastalığı12,13,14, Alzheimer hastalığı14, depresyon15 de dahil olmak üzere nörolojik ve nöropsikiyatrik bozukluklar11‘ de karıştığı olmuştur ,16,17, bipolar bozukluk18,19ve anksiyete20,21,22,23, 24. bu roller göz önüne alındığında, LC analizleri kendi işlev ve disfonksiyon eğitim için çok önemlidir.
Fareler fizyolojik ve Etyopatogenezi süreçleri çalışmaları için yaygın olarak kullanılır. Kendi küçük boyutu nedeniyle fareyi LC ~ 300 mikron, yapısı bulma zorluk için önde gelen bir ortalama çapındadır. Beyin kesit sırasında LC kolayca koronal veya sagittal bölümlerindeki özledim. Mevcut çalışmalar LC tanımlaması hayvanlarda açıklayan adım adım bir protokol sağlamıyorsa olmayan bir uzman1,25takip edebilirsiniz. Böylece, LC lokalizasyonu için rehberlik sunmak, biz çeşitli uygulamalar (şekil 1, Şekil 2, şekil 3) için fare beynindeki bu bölgeyi bulmak için geliştirdiğimiz bir protokol tanımlamak. Protokol dikkatle incelenmiş beyin kesit ve immunohistokimyasal olarak algılanmasını DBH26,27, ya da alternatif olarak TH24, son derece içinde LC28zenginleştirilmiş her iki enzim geçerlidir. LC immünhistokimya tarafından bulunan sonra bitişik beyin dilimleri için daha fazla çalışmalar, morfolojik ve metabolik analizleri, aynı zamanda x-ışını Floresans mikroskobu (XFM)29ile metal görüntüleme çalışmaları da dahil olmak üzere kullanılabilir. Bir örnek olarak bu Protokolü (şekil 3) XFM açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Düzgün örnek yönlendirme bu iletişim kuralı çok önemli bir adımdır. LC (beyincik ve aşağı olacaklar arasında sınır) bulmak için beyin dorsal yüzeyi anatomik özellikleri kullanmakta olduğunuz için bölümleri düzgün uyumlu önemlidir. Bu fare beyin dilimleyici matris beyin arızalı özen gerektirir. Anterior ve posteiror LC çekirdek eksik önlemek için daha fazla doku ~ 500 mikron kesme tavsiye ediyoruz. En yaygın hata LC tamamen eksik sonuçları çok az bölümleri azaltmak olduğunu. Böylece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Abigael Muchenditsi fare koloni bakımı için teşekkür ederim. ABD Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler, sözleşme numarası altında tarafından desteklenen Argonne Ulusal Laboratuvarı Gelişmiş foton kaynak kullanımı: DE-AC02-06CH11357. Biz Olga Antipova ve Dr. Stefan Vogt kullanıcı desteği ve gelişmiş foton kaynağında yardım için teşekkür ederiz. Bu eser SL için Ulusal Sağlık Enstitüsü grant 2R01GM101502 tarafından finanse edildi.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
References
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
- Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
- Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
- Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
- Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
- Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
- Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
- File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
- Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
- Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson’s disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
- Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson’s disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
- Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
- Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
- Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
- Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
- Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
- Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
- Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. 神经科学. 373, 7-19 (2018).
- Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
- McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
- Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
- Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
- Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
- Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
- Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
- Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
- Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
- Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
- Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson’s disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).
