לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר
Summary
Coeruleus לוקוס יש מקבץ קטן של נוירונים מעורב במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להתכונן חלקים במוח העכבר מחקרים של חלבונים, מתכות בגרעין הזה.
Abstract
Coeruleus לוקוס (LC) היא מרכז חשוב של נוראדרנלין לייצר נוירונים זה לווסת את מספר פונקציות פיזיולוגיים. מומים מבניים או פונקציונלי של LC להשפיע מספר אזורים במוח כולל קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן, עשוי לתרום דיכאון, הפרעה דו קוטבית, חרדה, כמו גם מחלת פרקינסון, אלצהיימר. הפרעות אלה הקשורים לעתים קרובות עם misbalance מתכת, אך התפקיד של מתכות LC מובנת באופן חלקי בלבד. מחקרים מורפולוגיות ופונקציונליים של LC נחוצים כדי להבין טוב יותר את פתולוגיות האנושית ואת התרומה של מתכות. עכברים הם מודל ניסיוני בשימוש נרחב, אבל העכבר LC הוא קטן (~0.3 מ”מ קוטר), קשה לזהות שאינו מומחה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס אימונוהיסטוכימיה צעד אחר צעד כדי להתאים לשפה של LC במוח העכבר. דופמין-β-hydroxylase. דבח, (. מלך אקסום), לחלופין, טירוזין hydroxylase (ה), שני אנזימים מאוד שבאה לידי ביטוי LC, משמשים כסמני immunohistochemical פרוסות המוח. מקטעים סמוכים למקטעים המכילים LC יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף, כולל היסטולוגיה מחקרים מורפולוגי, בדיקות מטבוליות, כמו גם הדמיה מתכת על ידי רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM).
Introduction
Coeruleus לוקוס (LC) הוא אזור חשוב לגזע המוח, האתר העיקרי של נוראפינפרין (NE) ייצור1. LC שולחת תחזיות ברחבי המוח2 קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן3 , ולאחר מווסת תהליכים פיזיולוגיים העיקריים, כולל שעון ביולוגי4,5, תשומת לב, זיכרון6, להדגיש7, תהליכים קוגניטיביים8ו9,רגש10. תפקוד לקוי של LC היה מעורב והפרעות נוירולוגיות מנוטלי11, כולל פרקינסון מחלת12,13,14, מחלת אלצהיימר14, דיכאון15 16, ,17, הפרעה דו קוטבית18,19, ו חרדה20,21,22,23, 24. בהתחשב תפקידים אלה, ניתוח של LC הוא חיוני כדי ללמוד שלה ותפקוד לקוי.
עכברים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים של הפיזיולוגיות תהליכים pathophysiologic. עקב גודלם הקטן, העכבר LC יש של קוטר ממוצע של μm ~ 300, שמוביל קושי באיתור המבנה. במהלך המוח חלוקתה, LC ניתן בקלות לוותר בסעיפים הילתית או הווריד. מחקרים זמין המתארת זיהוי של LC בבעלי חיים לא מציעים פרוטוקול צעד אחר צעד שאינו מומחה יכול לעקוב אחר1,25. לפיכך, להציע הדרכה והסבה של LC, נתאר את פרוטוקול שפיתחנו כדי לאתר אזור זה במוח העכבר עבור מספר יישומים (איור 1, איור 2, איור 3). הפרוטוקול חלה זיהוי חלוקתה, immunohistochemical המוח מבוקר בקפידה של דבח, מלך אקסום26,27, או לחילופין ה24, שני אנזימים מאוד מועשר בתמציות של LC28. ברגע LC ממוקם על-ידי אימונוהיסטוכימיה, המוח סמוך פרוסות יכול לשמש ללימודים נוספים, כולל ניתוח מורפולוגי, חילוף החומרים, כמו גם מתכת מחקרי הדמיה באמצעות קרני רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM)29. אנו מתארים XFM כדוגמה בפרוטוקול הזה (איור 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
כראוי המכוונת את הדגימה היא שלב קריטי פרוטוקול זה. מאחר ואנו משתמשים תכונות אנטומיות של המשטח הגבי של המוח כדי לאתר LC (הגבול בין המוח הקטן רקתי נחות), חשוב כי הסעיפים ליישר כהלכה. הדבר דורש טיפול בקביעת כראוי המוח לתוך מאטריקס מבצעה מוח העכבר. אנו ממליצים לחתוך ~ 500 μm יותר רקמות anterior ואת אחור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Abigael Muchenditsi על קיומו של המושבה העכבר. השימוש המקור הפוטון מתקדם ב Argonne National Laboratory נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, משרד של בסיסי אנרגיה למדעים, תחת מספר חוזה: דה-AC02-06CH11357. אנו מודים אולגה Antipova, ד ר סטפן ווגט על המשתמש תמיכה וסיוע למקור הפוטון מתקדם. עבודה זו מומן על ידי 2R01GM101502 גרנט המכון הלאומי לבריאות ל SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
References
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
- Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
- Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
- Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
- Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
- Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
- Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
- File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
- Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
- Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson’s disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
- Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson’s disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
- Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
- Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
- Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
- Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
- Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
- Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
- Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. 神经科学. 373, 7-19 (2018).
- Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
- McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
- Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
- Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
- Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
- Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
- Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
- Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
- Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
- Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
- Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson’s disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).
