Two-photon Imaging d’Attraction des microglies processus vers l’ATP ou la sérotonine cérébrale aiguë tranches
Summary
La microglie, les résidents cellules immunitaires du cerveau, répondre rapidement avec des changements morphologiques aux modifications de leur environnement. Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie biphotonique à étudier l’attraction des microglies processus vers la sérotonine ou l’ATP en tranches cérébrale aiguë des souris.
Abstract
Les cellules microgliales sont des cellules immunitaires innées résidents du cerveau qui constamment analyser leur environnement avec leurs longs prolongements et, à la perturbation de l’homéostasie, subissent des changements morphologiques rapides. Par exemple, une lésion laser induit en quelques minutes une croissance axée sur des processus microgliales, également appelé « motilité directionnelle », vers l’endroit de la blessure. Un effet similaire peut être obtenu en fournissant localement ATP ou la sérotonine (5-hydroxytryptamine [5-HT]). Dans cet article, nous décrivons un protocole pour induire une croissance directionnelle des microglies processus vers une application locale d’ATP ou 5-HT dans des tranches de cerveau aiguë des souris jeunes et adultes et à l’image de cette attraction au fil du temps par la microscopie multiphoton. On propose une méthode simple de quantification avec analyse d’images gratuit et open source. Un défi qui caractérise encore les tranches cérébrale aiguë est le temps limité, diminuant avec l’âge, au cours de laquelle les cellules demeurent dans un état physiologique. Ce protocole, par conséquent, souligne certaines améliorations techniques (imagerie chambre avec une perfusion double chambre interface medium, air liquide) visant à optimiser la viabilité des cellules microgliales pendant plusieurs heures, surtout dans les tranches de souris adultes.
Introduction
Les cellules microgliales sont les macrophages résidents du cerveau et jouent un rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques1,2. Ils ont une morphologie très ramifiée et sont constamment étendre et rétracter leur processus3,4. Ce comportement de « balayage » est censé être liées et nécessaires à l’enquête de leur environnement. La plasticité morphologique des microglies est exprimée en trois modes. Tout d’abord, certains composés modulent rapidement microgliales morphologie : l’addition d’ATP5,6 ou NMDA5,7 , dans le milieu de baignade tranches cérébrale aiguë accroît la complexité des microglies ramifications, Alors que la noradrénaline diminue il6. Ces effets sont directement médiées par les récepteurs microgliales (par l’ATP et de la noradrénaline) ou nécessitent une libération d’ATP des neurones (pour NMDA). En second lieu, la vitesse de croissance et rétraction des processus microgliales, appelé la motilité ou « surveillance », peut être affectée par des facteurs extracellulaires8, perturbations de l’homéostasie du9,10ou mutations9, 10,11. En troisième lieu, en plus de ces changements isotropes de morphologie et de la motilité, microglie ont la capacité d’étendre leurs processus déviés vers une pipette livrant ATP3,5,12, 13 , 14, la culture, en tranches cérébrale aiguë ou in vivo, ou livraison de 5-HT dans cérébrale aiguë tranches15. Une telle croissance axée sur des processus microgliales, également appelé motilité directionnelle, a été décrite comme une réponse à un laser local lésion3,4. Ainsi, physiologiquement, il peut être lié à la réponse à une lésion ou requis pour le ciblage des microglies processus vers les synapses ou régions cérébrales nécessitant l’élagage pendant développement15,16, ou enphysiologiques 17 ,18,19 ou situations pathologiques9,18,19,20 , à l’âge adulte. Les trois types de changements morphologiques s’appuient sur différents mécanismes intracellulaires de13,11,20, et une substance donnée ne pas nécessairement modulé chacun d’eux (p. ex., NMDA, qui agit indirectement sur la microglie, a un effet sur la morphologie, mais n’induit pas de motilité directionnelle5,,7). Par conséquent, lorsque le but de caractériser les effets d’un composé, une mutation ou une pathologie sur la microglie, il est important de caractériser les trois composantes de leur plasticité morphologique. Nous décrivons ici une méthode pour étudier la croissance directionnelle des microglies processus vers une source locale de composé, qui est, ici, ATP ou 5-HT.
Il existe plusieurs modèles pour étudier l’attraction des microglies processus : cultures primaires en environnement 3D6,18,19, cérébrale aiguë tranches6,13,15et in vivo imagerie des3,13. L’approche in vivo est le meilleur pour préserver l’état physiologique des cellules microgliales. Cependant, imagerie intravitale des régions profondes nécessite des interventions chirurgicales complexes et, par conséquent, il est souvent limité à des couches corticales superficielles. L’utilisation de culture primaire de cellules microgliales est la technique la plus simple pour tester un grand nombre de conditions avec un nombre limité d’animaux. Néanmoins, il est impossible d’obtenir la même morphologie cellulaire comme en vivo, et les cellules perdent leurs interactions physiologiques avec les neurones et les astrocytes. Tranches de cerveau aiguë représentent un compromis entre ces deux approches. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les structures cérébrales qui sont par ailleurs difficiles d’atteindre d’images à haute résolution in vivo et d’enquêter sur des tranches de stades néonatales, attendu que transcrânienne microscopie est principalement effectuée à l’âge adulte. Enfin, il rend possible d’observer en temps réel les effets de la demande de drogue local et de répéter les expériences tout en utilisant un nombre limité d’animaux. Néanmoins, un problème avec des tranches de cerveau aigu est le peu de temps (quelques heures) au cours de laquelle les cellules demeurent vivantes, notamment pour les tranches de souris plus de deux semaines et la variation du potentiel de la morphologie des cellules microgliales au fil du temps21,22 .
Nous décrivons ici un protocole visant à préparer des tranches de cerveau aiguë de jeunes et d’adultes Cx3cr1GFP / + souris jusqu’à deux mois, avec la préservation de la morphologie de la microglie et motilité pendant plusieurs heures. Nous, ensuite, décrivent comment utiliser ces tranches pour étudier l’attraction des microglies processus vers composés comme ATP ou 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par le maintien, à la différence en dissocié ou organotypique trancher une intégrité structurelle avec les réglages de réseau limité, de la culture, des tranches de cerveau aiguë aux chercheurs d’étudier des microglies dans leur environnement physiologique. Cependant, une des principales limites est le fait que la procédure de tranchage crée des blessures qui peuvent rapidement compromettre la viabilité des neurones, particulièrement dans le cerveau adulte. Comme les microglies sont particulièrement réa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les cellules et tissus Imaging Facility de l’Institut du Fer à Moulin, où toutes les image acquisition et l’analyse ont été effectuées. Ce travail a été soutenu en partie par le Centre National de la Recherche Scientifique, l’Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sciences de l’Université de la Sorbonne et par des subventions de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie université () Programme Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale « Equipe FRM DEQ2014039529 », le Ministère Français de la recherche (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 et l’avenir des Investissements du programme « Bio-Psy Labex » ANR-11-IDEX-0004-02) et une recherche Collaborative dans le programme de neurosciences computationnelles, National Science Foundation/Français Agence nationale pour la recherche (numéro : 1515686). Tous les auteurs sont affiliés à la recherche des groupes qui sont membres de l’école des neurosciences de Paris (PEV) et de la Bio-Psy Labex. F.E. est étudiant au doctorat affilié à la Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Paris, France et est financé par le Labex Bio-Psy. V.M. est stagiaire postdoctorale financé par la recherche Collaborative dans le programme de neurosciences computationnelles, National Science Foundation/Français Agence nationale pour la recherche (numéro : 1515686). Les auteurs remercient Marta Kolodziejczak qui ont participé à l’initiation du projet.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
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