Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상
Summary
Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Microglial 세포는 상주 타고 난 면역 세포는 뇌의 지속적으로 그들의 긴 프로세스와 그들의 환경을 스캔 하 고, 항상성 장애 시 빠른 형태학 상 변화를 받 다. 예를 들어 레이저 병 변 몇 분에 상해의 사이트를 향해 “방향 운동” 라고도 하는 microglial 프로세스의 중심된 성장을 유도 합니다. 로컬 ATP 또는 세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])를 제공 하 여 비슷한 효과 얻을 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 프로토콜 ATP 또는 5-젊은 성인 쥐의 급성 뇌 조각에 HT의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 방향 성장을 유도 하 고 시간이 지남에 따라이 매력 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 이미지를 설명 합니다. 무료 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어와 정량화의 간단한 방법을 제안 했다. 여전히 급성 뇌 조각 특징 도전은 감소 하는 세포 생리 상태에 남아 나이 제한 된 시간 이다. 이 프로토콜, 따라서, 특히 성인 쥐에서 조각에에서 몇 시간 동안 microglial 세포의 생존 능력을 최적화 겨냥 한 몇 가지 기술적인 개선 (중간, 공기-액체 인터페이스 챔버, 이중 관류와 챔버 이미징) 하이라이트.
Introduction
Microglial 세포 두뇌의 주민 대 식 세포는 고 두 생리 및 병 적인 조건1,2에 역할. 그들은 높게 분기 형태와는 끊임없이 확장 있고 그들의 프로세스3,4를 제거. 이 “스캔” 문제가 관련 되며 그들의 주위에의 조사에 필요한 여겨진다. Microglia의 형태소가 소성 세 가지 모드에 표시 됩니다. 첫째, 일부 화합물 빠르게 microglial 형태학을 조절: ATP5,6 또는 급성 뇌 조각 입욕 하는 매체에 NMDA5,7 microglial 파급 효과의 복잡성 증가 반면 norepinephrine 그것6감소 한다. 이러한 효과 직접 (대 한 ATP 및 norepinephrine) microglial 수용 체에 의해 중재 하거나 신경 세포에서 ATP 릴리스 (NMDA)에 대 한 필요 합니다. 둘째, 운동 성 또는 “감시”, microglial 프로세스의 성장과 수축 속도 extracellular 요인8, 항상성 중단9,10또는 돌연변이9에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 10,11. 셋째, 있을 뿐만 아니라 이러한 등방성의 형태와 운동 성 microglia ATP3,5,12, 를 제공 하는 피 펫으로 향해 그들의 프로세스를 확장 하는 수 용량이 있다 13 , 14, 급성 뇌 조각 또는 vivo에서, 또는 제공 5-HT 급성 뇌 조각15문화입니다. 방향 운동 성, 라고도 하는 microglial 프로세스의 이러한 지향된 성장 처음 로컬 레이저 병 변3,4에 대 한 응답으로 설명 했다. 따라서, 순수, 그것은 상해에 대 한 응답을 관련 되거나 시 냅 스를 향해 microglial 프로세스를 타겟팅에 필요한 또는 두뇌 지역 개발15,16, 동안 또는 생리17 가지 치기를 요구 ,,1819 또는 성인 기에 병 적인 상황9,18,,1920 . 세 가지 유형의 형태학 변화 다른 세포내 메커니즘11,,1320에 의존 하 고 한 주어진된 화합물 반드시 그들 (예를 들어, NMDA에 직접 역할을 하는 모두 변조 하지 않습니다. microglia, 형태에 영향을 하지만 방향 운동 성5,7을 유도 하지 않습니다). 따라서 때 microglia에 화합물, 돌연변이 또는 한 병 리의 효과 특성화를 목표로, 그들의 형태학 소성의 세 가지 구성 요소 특성 중요 하다. 여기, 우리는, 여기의 화합물, 로컬 소스, ATP 또는 5-HT microglial 프로세스의 방향 성장 연구 하는 방법을 설명 합니다.
일부의 모델이 microglia 프로세스 매력 공부: 3D 환경6,,1819, 급성 뇌 조각6,,1315, 그리고 vivo에서 주 문화 3,13이미지입니다. Vivo에서 접근 microglia의 생리 상태를 보존 하는 최고입니다. 그러나, 깊은 지역 intravital 이미징 필요 복잡 한 수술 과정 그리고, 그러므로, 그것은 종종 피상적 대뇌 피 질의 층으로 제한. Microglia 기본 문화권을 사용 하는 많은 동물의 제한 된 수를 가진 조건 테스트를 쉬운 기술입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비보, 에서처럼 같은 셀 형태를 얻을 수는 없습니다 그리고 셀 손실 신경와 이다 그들의 생리 적인 상호 작용. 급성 뇌 조각이 두 가지 방법 사이 타협을 대표 한다. 이 모델 transcranial 현미경 검사 법은 주로 성인에서 수행 하는 반면 어려운 도달 vivo에서, 높은 해상도 이미지 하 고 신생아 단계에서 분할 영역을 조사 하는 뇌 구조를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 지역 마약 응용 프로그램의 효과 실시간으로 관찰 하 고 실험 동물의 제한 된 수를 사용 하 여 반복 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 급성 뇌 조각 문제는 제한 된 시간 (몇 시간) 동안 셀21,22에 2 주, 그리고 microglia 형태학의 잠재적인 변화 보다 더 오래 된 쥐에서 조각을 위해 특히 살아 남아 .
여기, 우리는 젊은이 성인 Cx3cr1의 급성 뇌 슬라이스를 준비 하는 프로토콜을 설명GFP / + 마우스를 2 개월, 몇 시간 동안 microglia 형태 및 운동 성의 보존. 우리, 그럼, ATP 또는 5-HT 같은 화합물으로 microglial 프로세스의 매력을이 분할 영역을 사용 하는 방법을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유지, 달리에서 해리 또는 organotypic 슬라이스 문화, 구조적 무결성 제한 된 네트워크 조정, 급성 뇌 조각 허용 microglia 그들의 생리 적인 환경에서 공부 하는 연구자. 그러나, 주요 한계 중 하나는 조각화 절차 빠르게 특히 성인 두뇌에서에서 뉴런의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 부상 만듭니다 사실 이다. Microglia 특히 세포 손상에 반응으로, 그것은 가능한 그들의 생리 적인 상태에 가까운 microglia?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 세포와 조직의 이미징 시설 인 뒤 Fer à 무 랑, 어디 모든 이미지 수집 및 분석 수행 되었습니다 감사 합니다. 이 작품 일부는 센터 국립 드 라 검색 사이언스 인 국립 드 라 건강에 의해 지원 되었습니다 동부 표준시 드 라 공 들인 Médicale, 소 르 본 대학교 과학 그리고 소 르 본 Universités-피에르에서 교부 금에 의해 외 마리 퀴리 대학 ( Emergence-UPMC 프로그램 2011/2014)는 Fondation 부 la Recherche 쉬르 르 Cerveau, Fondation 드 프랑스에서 Fondation 라 검색 Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, 연구 (직원 회 부 라 Recherche 프랑스 정부, ANR-17-CE16-0008 및 Investissements d’Avenir 프로그램 “바이오 싸이 Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) 및 전산 신경 과학 프로그램, 연구를 위한 국립 과학 재단/프랑스 국가 기관에서에서 공동 연구 (번호: 1515686). 모든 저자는 연구 제휴는 파리 학교 신경 (ENP) 바이오 싸이 Labex의 구성원을 그룹화 합니다. F.E. 소 르 본 대학교, Collège 박사, F-75005 파리, 프랑스, 제휴 박사 학생 이며 바이오 싸이 Labex에 의해 자금이 다. V.M.은 박사 후 연구원 전산 신경 과학 프로그램, 국립 과학 재단/프랑스 국립 기관 연구에 대 한 공동 연구에 의해 투자 (번호: 1515686). 저자는 프로젝트의 개시에 참가 마르타 Kolodziejczak 감사 합니다.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
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