Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias
Summary
Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.
Abstract
Microglial são residentes inatas imunes células do cérebro que constantemente digitalizar seu ambiente com seus longos processos e, após o rompimento da homeostase, passam por rápidas mudanças morfológicas. Por exemplo, uma lesão do laser induz em poucos minutos um crescimento orientado de processos microglial, também chamado de “motilidade direcional”, para o local da lesão. Um efeito similar pode ser obtido através da entrega localmente ATP ou serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]). Neste artigo, descrevemos um protocolo para induzir um crescimento direcional de processos microglial em direção a uma aplicação local de ATP ou 5-HT em fatias aguda do cérebro de ratos jovens e adultos e a imagem esta atração ao longo do tempo por microscopia do multiphoton. Propõe-se um método simples de quantificação com software de análise de imagem livre e open-source. Um desafio que ainda caracteriza fatias cerebral aguda é o tempo limitado, diminuindo com a idade, durante o qual as células permanecem em um estado fisiológico. Este protocolo, portanto, destaques algumas melhorias técnicas (secção interface ar-líquido médio, imagem de câmara com uma dupla perfusão) visam otimizar a viabilidade de células microglial durante várias horas, especialmente em fatias de ratos adultos.
Introduction
Microglial células são macrófagos residentes do cérebro e desempenham um papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas1,2. Eles têm uma morfologia altamente ramificada e são constantemente ampliar e retraindo seus processos3,4. Esse comportamento de “digitalização” é acreditado para ser relacionadas e necessárias para o levantamento de seus arredors. A plasticidade morfológica da micróglia é expressa em três modos. Primeiro, alguns compostos rapidamente modulam microglial morfologia: a adição de ATP5,6 ou5,de NMDA7 no meio de banho fatias cerebral aguda aumenta a complexidade das ramificações microglial, Considerando que a noradrenalina diminui-lo6. Estes efeitos são diretamente mediados por receptores de microglial (para ATP e norepinefrina) ou requerem uma liberação de ATP de neurônios (NMDA). Em segundo lugar, a velocidade de crescimento e retração de processos microglial, chamado de “vigilância”, ou motilidade pode ser afetada por fatores extracelulares8, homeostase interrupções9,10ou mutações9, 10,11. Em terceiro lugar, para além destas alterações isotrópicas de morfologia e motilidade, microglia têm a capacidade de estender seus processos direcionalmente em direção a uma pipeta entregando ATP3,5,12, 13 , 14, na cultura, em fatias de cérebro aguda ou in vivo, ou entregando 5-HT cerebral aguda fatias15. Tal crescimento orientado de processos microglial, também chamado de motilidade direcional, foi descrito pela primeira vez como uma resposta a uma lesão de laser local3,4. Assim, fisiologicamente, pode ser relacionado com a resposta à injúria ou necessária para o direcionamento de processos microglial para sinapses ou regiões do cérebro que exigem poda durante desenvolvimento15,16, ou em fisiológicas17 ,18,19 ou situações patológicas9,18,19,,20 em idade adulta. Os três tipos de alterações morfológicas dependem de diferentes mecanismos intracelulares11,13,20, e um determinado composto não necessariamente modulam todas elas (por exemplo, NMDA, que age indiretamente na microglia, tem um efeito sobre a morfologia, mas não induz a motilidade direcional5,7). Portanto, quando, com o objetivo de caracterizar o efeito de um composto, uma mutação ou uma patologia na microglia, é importante caracterizar os três componentes da sua plasticidade morfológica. Aqui, descrevemos um método para estudar o crescimento direcional de processos microglial na direção de uma fonte local de composto, que é, aqui, ATP ou 5-HT.
Existem vários modelos para estudar a atração dos processos microglia: culturas primárias em ambiente 3D6,18,19, fatias do cérebro aguda6,13,15e na vivo imagem3,13. A abordagem em vivo é o melhor para preservar o estado fisiológico da micróglia. No entanto, intravital imagem de regiões profundas exige procedimentos cirúrgicos complexos e, portanto, muitas vezes é limitado às camadas corticais superficiais. O uso de cultura primária microglia é a técnica mais fácil de testar um grande número de condições, com um número limitado de animais. No entanto, é impossível obter a mesma morfologia celular como vivo, e as células perdem suas interações fisiológicas com neurônios e astrócitos. Fatias de cérebro aguda representam um compromisso entre essas duas abordagens. Este modelo permite aos pesquisadores estudar estruturas cerebrais que são de outra maneira difíceis de alcançar e para imagem com alta resolução em vivo e para investigar fatias de estágios neonatais, Considerando que a microscopia transcraniana é realizada principalmente na idade adulta. Finalmente, ele torna possível observar em tempo real os efeitos da aplicação da droga local e de repetir experiências enquanto estiver usando um número limitado de animais. No entanto, um problema com fatias de cérebro aguda é o tempo limitado (algumas horas), durante o qual as células permanecem vivas, nomeadamente para fatias de ratos mais de duas semanas e a possível mudança da morfologia microglia sobre tempo21,22 .
Aqui, descrevemos um protocolo para preparar fatias aguda do cérebro de jovens e adultos Cx3cr1GFP / + ratos até dois meses de idade, com a preservação da microglia morfologia e motilidade durante várias horas. Em seguida, descrevemos como usar essas fatias para estudar a atração dos processos microglial para compostos como o ATP ou 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mantendo-se, ao contrário de em dissociada ou organotypic fatia de cultura, uma integridade estrutural com ajustes de rede limitada, fatias de cérebro aguda permitem aos pesquisadores estudar microglia no seu ambiente fisiológico. No entanto, uma das principais limitações é o fato de que o procedimento de corte cria lesões que rapidamente podem comprometer a viabilidade de neurônios, particularmente no cérebro adulto. Como microglia são particularmente reactivo ao dano celular, é importante limitar a morte cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a célula e tecido Imaging facilidade do Institut du Fer à Moulin, onde foram realizados todos os aquisição de imagem e análise. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Centre National de la Recherche Scientifique, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Ciências da Université de Sorbonne e por concessões da Sorbonne universidades-Pierre et Marie Curie University ( Programa Emergence-UPMC 2011/2014), da Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, a Fondation de France, a Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, o Ministério francês da pesquisa (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 e o d’Avenir Investissements programa “Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) e uma pesquisa colaborativa em programa de neurociência computacional, Science Foundation/francês nacional Agência Nacional para a pesquisa (número: 1515686). Todos os autores são filiados à investigação de grupos que são membros da escola de Paris de neurociência (PEV) e do Labex Bio-Psy. Fe é um estudante de doutorado filiado a Sorbonne Université, Collège doutoral, F-75005 Paris, França e é financiado pelo Labex Bio-Psy. V.M. é bolsista de pós-doutoramento financiada pela pesquisa colaborativa em programa de neurociência computacional, Science Foundation/francês nacional Agência Nacional para a pesquisa (número: 1515686). Os autores graças a Marta Kolodziejczak que participaram no início do projeto.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
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