Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung
Summary
Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.
Abstract
Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Neisseria Gonorrhoeae (GC) ist ein weltweit Gesundheitsrisiko dar und unterstreicht die Notwendigkeit, Personen zu identifizieren, die Behandlung nicht. Dieses gramnegatives Bakterium verursacht Gonorrhoe ausschließlich beim Menschen. Während der Infektion ist es in der Lage, Form Aggregate und/oder Biofilme. Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Test dient für Anfälligkeit gegen Antibiotika zu bestimmen und entsprechenden Behandlung zu definieren. Der Mechanismus der die Beseitigung der in-vivo und ihre Beziehung zur Laborergebnisse sind nicht bekannt. Eine Methode, die untersucht, wie GC Aggregation Antibiotikaempfindlichkeit beeinflusst und zeigt die Beziehung zwischen aggregierte Größe und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde entwickelt. Wenn GC Aggregat sie resistenter gegen Antibiotika töten sind, überleben mit Bakterien im Zentrum Ceftriaxon-Behandlung besser als in der Peripherie. Die Daten zeigen, dass N. Gonorrhoeae Aggregation seiner Anfälligkeit für Ceftriaxon, reduzieren kann, was nicht mit den standard Agar-Platte-basierte MIC Methoden widerspiegelt. In dieser Studie verwendete Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Anfälligkeit unter klinisch relevanten Bedingungen zu testen.
Introduction
Gonorrhoe ist eine gemeinsame sexuell übertragbare Infektionen (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), ein gramnegatives diplococcal Bakterium ist der Erreger dieser Krankheit. Symptome der genitalen Infektion führt zu Schmerzen beim Wasserlassen, generalisierte genitale Schmerzen und Harnröhre entladen. Infektion ist oft asymptomatisch2,3,4,5, und dies ermöglicht eine erweiterte Kolonisation. Diese unbehandelten Infektionen sind ein großes gesundheitliches Problem, da sie das Potenzial, die Übertragung des Organismus zu erleichtern und dies kann zu Komplikationen wie Adnexitis (PID) und verbreitet Gonokokken-Infektion (DGI)6. Antibiotika-resistenten Tripper ist eine Krise des öffentlichen Gesundheitswesens und eine zunehmende sozioökonomische Last7. Geringere Anfälligkeit für Cephalosporine führte Behandlung Therapie Wechsel von ein einziges Antibiotikum zur dualen Therapie verbindet Azithromycin oder Doxycyclin mit Ceftriaxon8. Das erhöhte Scheitern von Ceftriaxon und Azithromycin9,10, in Kombination mit asymptomatische Infektionen, unterstreicht die Notwendigkeit der Gonorrhoe Behandlungsversagen zu verstehen.
Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)-Test, einschließlich der Agar-Verdünnung und Disc-Diffusion-Tests, wurde als der standard medizinischer Test zur Identifizierung von Widerstand gegen ein Antibiotikum eingesetzt. Es ist jedoch unklar, ob der MIC Test bakterielle Resistenz gegen Antibiotika in-vivo widerspiegelt. Die Entstehung von bakteriellen Biofilmen trägt für das Überleben der Bakterien im Beisein von bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums: die MIC-Tests sind nicht in der Lage, diesen Effekt11zu erkennen. Weil GC auf Schleimhaut-Oberflächen12Biofilme bilden kann, wir stellen die Hypothese auf, dass Antibiotikum Anfälligkeit innerhalb Aggregate wäre anders als in einzelnen GC gesehen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass drei–Variable Oberflächenmoleküle, Pili, Deckkraft-assoziierten Protein (Opa Phasen) und Lipooligosaccharides (LOS), die Inter Bakterie Interaktionen regulieren, zu verschiedenen großen Aggregate13, führen 14 , 15. der Beitrag dieser Komponenten zu Antibiotika-Resistenz wurde nicht durch den Mangel an geeigneten Methoden geprüft.
Derzeit gibt es mehrere Methoden, um die Beseitigung der Biofilm zu messen. Die am weitesten verbreitete quantitative Methode ist durch Messung der Biomasse mit Kristallviolett16Färbung. Die Methode erfordert jedoch erhebliche experimentelle Manipulation, die möglicherweise Fehler im Experiment wiederholt17erzeugen kann. Die lebenden/Toten Färbung Methode hier ermöglicht die Visualisierung von lebenden und toten Bakterien und deren Verteilung innerhalb der Biofilm. Die Biofilm-Struktur kann jedoch als eine physikalische Barriere darstellen, die Farbstoff eindringen reduziert. Daher beschränkt sich um lebenden/Toten Bakterien innerhalb einer Gruppe zu quantifizieren, die Färbung auf kleine Biofilmen oder seine Vorläufer-Mikrokolonien oder Aggregationen. Andere Methoden, einschließlich der Agar Verdünnung und Disc Verbreitung Tests sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der Aggregation zu messen. GC-Anfälligkeit in Aggregation nach antibiotische Belichtung, eine ideale Methode untersuchen brauchen haben beide ein quantitativen Assay, der messen kann lebende Bakterien und deren Verteilung zu visualisieren.
Das hier beschriebene Verfahren kombiniert eine ATP-Nutzung-Messung und einer lebenden/Toten Färbung quantitativ zu bestimmen und visuell prüfen GC Anfälligkeit innerhalb Aggregate in Anwesenheit von Antibiotika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterien können Biofilme bilden, während der Infektion des menschlichen Körpers. Traditionelle kann MIC die Konzentration erforderlich, um die Beseitigung der Bakterien im Biofilm reflektieren nicht. Um Antibiotika Auswirkungen auf einen Biofilm zu testen, können Methoden auf Basis von Biofilm Biomasse sowie die Beschichtung KBE aufgrund der Auswirkungen der Biofilm Struktur fehlerhaft sein. Beispielsweise funktioniert die Beschichtung-Methode nur, wenn der Biofilm gestört werden kann. Daher kann die KBE erhalten n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des National Institute of Health, D.C.S. und w.s. AI123340. L.-c.w., j.w., A.C. und E.N wurden in Teil/Teilnahme an “The First Year Innovation & Forschung Experience”-Programm von der University of Maryland finanziert unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studie Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir anerkennen die UMD CBMG Imaging Core für alle Mikroskopie-Experimente.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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