Summary

Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Простой АТФ измерительные пробирного и/мертвые окрашивания метода были использованы для количественной оценки и визуализировать Neisseria gonorrhoeae выживание после лечения с Цефтриаксон. Этот протокол может быть расширен для изучения антимикробного воздействия любой антибиотик и может использоваться для определения минимальной ингибирующее концентрацию антибиотиков в бактериальные биопленки.

Abstract

Появление устойчивых к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae (GC) представляет собой угрозу для здоровья во всем мире и подчеркивается необходимость выявления лиц, которые не лечение. Это грамотрицательные бактерии вызывает гонорею исключительно в организме человека. Во время инфекции она способна формы агрегатов и/или биопленки. Минимальная концентрация тормозной (MIC) тест используется для определения чувствительности к антибиотикам и определить соответствующее лечение. Однако механизм ликвидации в естественных условиях и его связь с лабораторных результатов не известны. Был разработан метод, который проверяет как GC агрегации влияет на чувствительности к антибиотикам и показывает связь между совокупный размер и чувствительности к антибиотикам. Когда GC агрегат, они более устойчивы к антибиотикам убийства, с бактериями в центре выжившие Цефтриаксон лечения лучше, чем те, на периферии. Эти данные указывают, что N. gonorrhoeae агрегирование может уменьшить свою подверженность цефтриаксон, который не отражается Стандартный агар пластины-методов на основе MIC. Метод, используемый в данном исследовании позволит исследователям для тестирования бактериальных Восприимчивость клинически соответствующих условиях.

Introduction

Гонорея является общим половым путем инфекции (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), грамотрицательные бактерии diplococcal, является возбудителем этого заболевания. Симптомы инфекции половых органов может привести к боли во время мочеиспускания, обобщенные половых боль и мочеиспускательного канала разряда. Инфекция часто бессимптомной2,3,,45, и это позволяет для расширенной колонизации. Эти необработанные инфекций являются основных проблем системы здравоохранения, поскольку они имеют потенциал для облегчения передачи организма, и это может привести к осложнениям, например, воспалительные заболевания тазовых органов (PID) и распространены гонококковая инфекция (DGI)6. Устойчивых к антибиотикам гонорея — кризис общественного здравоохранения и растущее социально-экономическое бремя7. Уменьшенной восприимчивости к цефалоспорины привело к изменению режима лечения от одного антибиотика для двойной терапии, которая сочетает в себе доксициклина или азитромицина с Цефтриаксон8. Увеличение неудача Цефтриаксон и азитромицин9,10, в сочетании с бессимптомной инфекции, подчеркивает необходимость понимания неудач лечения гонореи.

Минимальная концентрация тормозной (MIC) теста, включая агар разрежения и диск диффузии испытаний, был использован как стандартный медицинский тест для определения устойчивости к антибиотикам. Тем не менее неясно, если тест MIC отражает бактерий к антибиотикам в естественных условиях. Формирование бактериальные биопленки способствует выживания бактерий в присутствии бактерицидные концентрации антибиотика: MIC тестирования не удается обнаружить этот эффект11. Потому что GC может формировать биоплёнки слизистой поверхности12, мы предполагаем, что антибиотика чувствительности в пределах агрегатов будет отличаться от что видел в отдельных GC. Кроме того исследования показали, что трехфазные переменной поверхности молекул, пили, непрозрачность связанные белком (Opa), и lipooligosaccharides (Лос), которые регулируют взаимодействие между бактерия, привести к различным размером агрегатов13, 14 , 15. вклад этих компонентов к антибиотикам не были рассмотрены из-за отсутствия надлежащих методов.

В настоящее время существует несколько методов для измерения искоренение биопленки. Наиболее широко используемый количественных методом является измерение изменений в биомассе, используя фиолетовый кристалл, окрашивание16. Однако этот метод требует значительных экспериментальных манипуляций, который потенциально может генерировать ошибки в эксперимент повторяется17. Метод окрашивания жить/мертвые, используемый здесь позволяет визуализации живых и мертвых бактерий и их распределения в рамках биопленки. Однако структура биопленки может представлять как физический барьер, который уменьшает проникновение красителя. Таким образом для количественной оценки жить/Мертвые бактерии внутри группы, окрашивание ограничивается малых биоплёнки или его предшественником microcolonies или агрегатов. Другие методы, включая тесты диффузии агар разрежения и диск, не способны измерить воздействие агрегации. Для изучения GC восприимчивость внутри агрегата после антибиотикотерапии экспозиции, идеальный метод будет необходимо иметь оба количественных assay который может измерить живут бактерии и визуализировать их распределения.

Процедуру, описанную здесь сочетает АТФ использование измерения и жить/мертвые пятнать количественно assay для и визуально изучить вызовы GC восприимчивость в агрегаты присутствии антибиотики.

Protocol

1. Общее обслуживание штаммов GC Полоска штаммы N. gonorrhoeae GCK агар с 1% Келлогг дополняет18 (Таблица 1, таблица 2) из морозильника запасов и инкубировать 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч. Использование MS11 выражая фаза переменная опа (MS11Opa +), без опа (MS11ΔOpa), или усеченных Ло?…

Representative Results

Использовались два метода: assay использования СПС и жить/мертвые окрашивание assay. Результаты можно либо объединить, или индивидуально используется для изучения бактериальных выживания в рамках агрегатов после лечения антибиотиками. Было показано, что СПС использовани…

Discussion

Бактерии могут образовывать биоплёнки во время инфекции человеческого тела. Традиционные MIC тестирования может не отражать концентрации, необходимые для искоренения бактерий в биопленки. Чтобы проверить влияние антибиотиков на биопленки, методы, основанные на биопленки биомассы, а т?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грант от национального института здравоохранения д.х.н. и в.с. AI123340. Л-К.В, J.W., переменного тока, и е.н. были поддержаны в части/участие в программе «Первый год инноваций и исследований опыт», финансируемого университета штата Мэриленд. Спонсоры имел никакой роли в исследования дизайн, сбор данных и анализ, решение публиковать, или подготовка рукописи. Мы признаем UMD CBMG изображений ядра для всех экспериментов микроскопии.

Materials

100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

References

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

View Video