בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים
Summary
Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.
Abstract
הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.
Introduction
זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)6. זיבה עמידים לאנטיביוטיקה היא משבר בריאות הציבור העיקריים של הגדלת נטל חברתי-כלכלי7. הרגישות מופחתת צפלוספורינים הביא שינוי משטר טיפול אנטיביוטיקה יחיד לטיפול כפול, המשלב azithromycin או דוקסיציקלין עם צפטריאקסון8. הכשל מוגברת של צפטריאקסון, azithromycin9,10, בשילוב עם זיהומים אסימפטומטיים, מדגיש את הצורך להבנת כשלים טיפול בזיבה.
המבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כולל אגר דילול ולדיסק דיפוזיה בדיקות, שימשה הבדיקה הרפואית סטנדרטי לזיהוי עמידות בפני אנטיביוטיקה. עם זאת, לא ברור אם הבדיקה מיקרופון משקף חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה ויוו. היווצרות biofilms חיידקי תורמת ההישרדות של החיידקים בנוכחות ריכוזים אחרים של אנטיביוטיקה: הבדיקה מיקרופון אין אפשרות לזהות את אפקט11. כי GC יכול ליצור biofilms על משטחים הרירית12, אנחנו משערים אנטיביוטיקה זה הרגישות בתוך אגרגטים יהיה שונה כי ראיתי ב- GC בודדים. בנוסף, מחקרים הראו כי שלב שלוש מולקולות על פני משתנה, פילי, חלבונים הקשורים אטימות (אופה), lipooligosaccharides (לוס), המסדירים את האינטראקציות הבין-חיידק, להוביל אגרגטים בגדלים שונים13, 14 , 15. התרומה של רכיבים אלה כדי עמידות לאנטיביוטיקה לא נבדקה עקב המחסור של שיטות נאותה.
כיום, ישנן מספר שיטות למדידת biofilm מיגור. כמותיים השיטה הנפוצה ביותר היא על ידי מדידת שינויים ביומסה באמצעות קריסטל ויולט מכתים16. עם זאת, השיטה דורשת משמעותי מניפולציה ניסויית, אשר יכולים ליצור פוטנציאל שגיאות ניסוי חזרה17. שיטת צביעת חי/מת המשמשת כאן מאפשר הדמיה של חיידקים מתים וחיים והפצה שלהם בתוך biofilm. עם זאת, המבנה biofilm יכול להוות מכשול פיסי אשר מפחית את צבען חדירה. לכן, לכמת חיידקים חיים/מתים בתוך קבוצה, ההכתמה היא מוגבלת biofilms קטן או קודמן-microcolonies או הסיכומים שלה. שיטות אחרות, לרבות אגר דילול ולדיסק דיפוזיה הבדיקות, אינם יכולים למדוד את ההשפעות של צבירה. לבחון GC הרגישות תוך צבירת לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה, שיטה אידיאלית צריך לקיים את שניהם assay כמותיים שיכול למדוד לחיות חיידקים והמחש ההפצה שלהם.
ההליך המתואר כאן משלב המדידה של ATP-ניצול, חי/מת מכתים הנועד באופן כמותי, בחנו ויזואלית GC הרגישות בתוך אגרגטים בנוכחות אנטיביוטיקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פוע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות D.C.S., W.S. AI123340. ל’, סי-וו. וו, איי. סי., והסתייעות E.N. ב חלק/להשתתף בתוכנית “בשנה הראשונה חדשנות & מחקר ניסיון” ממומן על ידי אוניברסיטת מרילנד. התורמים שחיים היה אין תפקיד לימוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם, או אופן ההכנה של כתב היד. אנו להכיר UMD CBMG הדמיה הליבה עבור כל הניסויים מיקרוסקופ.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
