زرع داخل البطين من السلائف العصبية المهندسة لدراسات الهندسة العصبية في الجسم الحي
Summary
استنادا ً إلى الهندسة الفيروسية في المختبر للسلائف العصبية، وزرعها المشترك في العقول البرية والتقييم المورفومتري المقترن لمشتقات “الاختبار” و”التحكم”، تسمح هذه الطريقة بنمذجة دقيقة للتحكم في الجينات الحية للنيوكورتيكال مورفولوجيا الخلايا العصبية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة.
Abstract
السيطرة الجينية على الخلايا العصبية هي حاليا موضوع تحقيق مكثف. يوصف هنا هو طريقة بسيطة وضعت لدراسة في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من مورفولوجيا الخلايا العصبية الإسقاط neocortical. ويستند هذا الأسلوب على (1) في الهندسة في المختبر lentiviral من السلائف العصبية كما “اختبار” و “السيطرة” الخلايا، (2) زرع مشترك في العقول البرية من نوع، و (3) تقييم مورفومتري المقترنة من مشتقاتها العصبية. وعلى وجه التحديد، تستخدم السلائف البللة E12.5 من المتبرعين بالخلايا العصبية، والمسمى وراثيا، لهذا الغرض. وهي مصممة للاستفادة من المروجين المختارين وتكنولوجيا التيتون/أوف، وهي مزروعة يدوياً حرة في البطينين الجانبيين حديثي الولادة. في وقت لاحق، عند التنميط المناعي للعقول المتلقية، يتم تغذية الصور الظلية من الخلايا العصبية المزروعة في برامج المصدر المفتوح NeurphologyJ، يتم استخراج المعلمات مورفومترية، ويتم حساب متوسط الطول ومؤشر المتفرعة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، وهذا واحد يقدم ثلاث مزايا رئيسية: أنه يسمح بتحقيق رقابة دقيقة على التعبير عبر الجينات بتكاليف معقولة، فإنه يتطلب فقط المهارات الجراحية الأساسية، ويوفر نتائج موثوقة إحصائيا عند تحليل محدود عدد الحيوانات. غير أنه بسبب تصميمه، فإنه لا يكفي لمعالجة السيطرة غير المستقلة للخلايا على الهندسة العصبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يفضل أن تستخدم للتحقيق في السيطرة على مورفولوجيا النيورايت بعد الانتهاء من الهجرة العصبية. في تركيبته الحالية، يتم ضبط هذه الطريقة بشكل رائع للتحقيق في السيطرة الجينية على بنية الخلايا العصبية الجديدة الجلوتاماستيك. الاستفادة من خطوط المعدلة وراثيا التعبير عن EGFP في أنواع الخلايا العصبية محددة أخرى، فإنه يمكن إعادة الغرض لمعالجة السيطرة الجينية من هندستها المعمارية.
Introduction
هنا نقوم بوصف طريقة بسيطة وضعناها لتشريح في السيطرة على الجينات في الجسم الحي من الخلايا العصبية. استنادا إلى الهندسة في المختبر من السلائف العصبية، وزرعها في الدماغ حديثي الولادة والتقييم المورفومتري المقترن من “اختبار” و “السيطرة” الخلايا، فإنه يسمح للكشف عن الآثار الوظيفية للجينات اختبار في السيطرة الدقيقة على مورفولوجيا الخلايا العصبية في طريقة سريعة وبأسعار معقولة. للتحقيق في السيطرة على الجينات الحية للهندسة العصبية العصبية، يجب معالجة ثلاث قضايا تقنية رئيسية: (1) تحقيق تعبير جين الاهتمام (GOI) منقوشة بشكل كاف ومراقبة كمية دقيقة منه؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية الكافية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (2) تحقيق مجموعة من الجينات ذات الأهمية ومراقبة كمية دقيقة لها؛ (3) تحقيق ذلك التعبير المنقوش بشكل كاف. (2) الحصول على تصور مجزأة بشكل صحيح من الصور الظلية العصبية متميزة؛ (3) استخلاص الأهمية الإحصائية للنتائج مع توظيف عدد محدود من الحيوانات.
عندما تكون متاحة، قد تكون خطوط متحولة الماوس التي تأوي التتراسيكلين (تيت) التي تسيطر عليها الجينات المتحولة أفضل أداة لمعالجة العدد الأول1. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام التثناع الجسدي. في مثل هذه الحالات ، يتم تسليم الترانسجين عن طريق الكهرباء2 أو التحويل الفيروسي3. بعد ذلك، يتم الاحتفاظ به كإبيسوم (على سبيلالمثال، على الكهربة القياسية 4)، أو يتم دمجها في الجينوم (عشوائيا، عن طريق integrase الرجعية5؛ أو في موقع محدد، عن طريق كريسبر الترويج لإعادة تركيبة متجانسة (SLENDR)6 ).
ثانياً، يمكن تحقيق تصور الصور الظلية العصبية من خلال (أ) وضع العلامات الموحدة المتناثرة أو (ب) وضع العلامات التفاضلية الكثيفة. أما بالنسبة لوضع العلامات متفرقة، يمكن استخدام منهجيات متقدمة مثل Golgi7، يمكن ملء مصغرات الخلايا العصبية المختارة من قبل biocytin8، ويمكن الحصول على وضع العلامات الملح والفلفل بفضل transgene معبر عن هائج. مثل هذا الجين قد يعرض النسخ المتنوع (Thy-EGFP)9 أو يمكن تنشيطه عن طريق إعادة تركيب ة الاستوكاستك (MORF)10. أما بالنسبة لـ (ب)، فإن الاستراتيجيات المتطورة تشمل إعادة تركيب الاستوكاستك بوساطة كري ضمن صفيف متعدد البروتينات الفلورية (Brainbow)11،فضلاً عن التكامل الجيني الذي يحركه البيكونباك-ترانسبوساز لجينات البروتين الفلوري، سابقاً تسليمها عن طريق التثناق الجسدي (CLoNE)12.
أما بالنسبة للمسألة الثالثة، فإن النتيجة المورفومترية تتأثر في كثير من الأحيان بتباين عشوائي كبير، ينشأ عن الاختلافات بين الحيوانات والطوارئ المتعلقة بحقن الخلايا. ولهذا الغرض، يستخدم عادة عدد كبير من الحيوانات لتحقيق القوة الإحصائية اللازمة لتقييم النشاط المورفولومتري GOI.
وكثيرا ما تعتمد النهج التي سبق وصفها على المهارات التقنية المتقدمة وتتطلب موارد مالية واضحة، مما قد يحد من انتشارها داخل الأوساط العلمية. للتحايل على هذه القضايا، تصورنا خط أنابيب سهلة ومباشرة لتشريح السيطرة الجينية للهندسة العصبية في الجسم الحي بطريقة سريعة وبأسعار معقولة. هذا مستوحى من تصميم مماثل زرع مشترك وضعت سابقا لسريع في تقييم الجسم الحي للنشاط عبر الانترابسيتش13.
وعلى وجه التحديد، يعتقد أن الزرع المشترك للسلائف العصبية “الخضراء” المهندسة في المختبر (“اختبار” و “التحكم” الخلايا) في الدماغ “الأسود” الوليد المتلقي يمكن أن يصلح في وقت واحد القضايا الرئيسية الثلاث المذكورة أعلاه. في الواقع، في المختبر الهندسة اللينفيروسير من السلائف، في ظروف تسيطر عليها جيدا، ويسمح الحفاظ على تقلب التعبير عبر الخلايا في الحد الأدنى، أقل بكثير من تلك المرتبطة عادة في التلاعب الجسدية في الجسم الحي (التي أجريت سابقا 14 سنة , 15 وفي نتائجنا غير المنشورة). والسيطرة الدقيقة الناتجة عن ذلك على التعبير الجيني قابلة للمقارنة مع تلك التي حققتها النماذج المحورة وراثيا التي تسيطر عليها التي تسيطر عليها التيت. ومع ذلك، فإن تكاليف هذا الإجراء أقل بكثير من تلك الناشئة عن صيانة خط ماوس المعدل وراثياً. بعد ذلك، حقن الخلايا الحرة سهلة وتتطلب الحد الأدنى من التدريب. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة ضبط كمية السلائف المسماة التي تحقن في كل دماغ لتحقيق عدد تراكمي كاف من السلائف الموزعة توزيعا ضئيلا، مع الإبقاء أيضا على العدد الإجمالي للالحيوانات المزروعة عند الحد الأدنى. وأخيراً وليس آخراً، فإن الحقن المشترك للسلائف ذات العلامات الفلورية المختلفة و”الاختبار” و”المراقبة” والتحليل الإحصائي الثنائي اللاحق للنتائج يتصدى لآثار التغير التجريبي بين الحيوانات، مما يسمح بالوصول إلى الأهمية الإحصائية للنتائج، حتى بعد تحليل عدد محدود من الأفراد13.
وينبغي التأكيد على أن هذه الطريقة، وإن كانت سريعة ورخيصة، لها لدينا قيودان رئيسيتان. أولا، تم تصميمه للتحقيق في السيطرة الجينية الخلية المستقلة من العمارة العصبية، وليس من المناسب لمعالجة السيطرة البيئية. ثانيا، كما السلائف العصبية المزروعة تصل إلى موقعها النهائي من قبل جدول زمني غير متجانسة، وهذا الأسلوب هو أفضل من نموذج التحكم neuroarchitectonics التي تحدث الانتهاء من الهجرة الماضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وجوانب/خطوات محددة من هذا الإجراء حاسمة وتتطلب اهتماما خاصا. أولاً، (أ) يجب أن يكون المشغلون مدربين مسبقاً بشكل كاف ٍ للتعامل بأمان مع الفيروسات اللينة في بيئة مختبر متوافقة مع BSL-2. ثانيا، (ب) قبل خلط “اختبار” و “السيطرة” الاستعدادات العصبية، فإنه من الإلزامي لغسل بعناية اثنين من تعليق المحيط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر مين دوك دو على إسهامه في الإعداد المبكر لهذا الإجراء.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
- Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. . Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
- Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
- Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
- Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
- Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
- Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
- Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
- Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
- Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
- . . NeurphologyJ Manual. , (2012).
- Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).
