工程神经前体宫内移植,用于Vivo神经结构研究
Summary
该方法基于神经元前体的体外慢病毒工程,将其共同移植到野生型大脑中,并配对对”测试”和”控制”衍生物的形态学评价,从而能够精确建模新皮质的体内基因控制神经元形态,以简单和负担得起的方式。
Abstract
神经元细胞结构的基因控制是当前深入研究的对象。本文介绍了一种用于研究新皮质投影神经元形态的体内基因控制的简单方法。该方法基于(1)神经元前体的体外慢病毒工程作为”测试”和”控制”细胞,(2)它们共同移植到野生型大脑,和(3)对其神经元衍生物的成对形态评估。具体来说,来自具有遗传标记的遗传性捐赠者的E12.5的皮质前体被用于这一目的。它们被设计成利用选定的启动子和ttON/OFF技术,它们被徒手移植到新生儿侧心室。之后,在受体大脑的免疫荧光分析后,将移植神经元的轮廓输入NeurphlogyJ开源软件,提取其形态参数,并计算平均长度和分支指数。与其他方法相比,这种方法具有三个主要优点:它允许以负担得起的成本实现对转基因表达的精细控制,它只需要基本的外科技能,并且在分析有限的动物的数量。然而,由于其设计,它不足以解决神经结构的非细胞自主控制。此外,最好在神经元迁移完成后,将其用于研究中性石形态控制。在其目前的配方中,该方法经过精心调整,以研究谷胱甘肽新皮质神经元结构的基因控制。利用其他特定神经细胞类型中表达EGFP的转基因线,可以重新用于解决其结构的基因控制问题。
Introduction
在这里,我们描述了一个简单的方法,我们开发解剖神经元细胞结构的体内基因控制。基于神经元前体的体外工程,将其移植到新生儿大脑中,并配对对”测试”和”控制”细胞的形态评价,从而在快速且经济实惠的方式。为了研究神经元结构的体内基因控制,必须解决三个关键技术问题:(1)实现适当的模式性兴趣基因(GOI)表达和准确的定量控制;(2) 获得不同神经元轮廓的恰当分段可视化;(3) 在雇用有限数量的动物的同时,得出结果的统计意义。
如果可用,携带四环素(tt)控制的转基因的小鼠突变线可能是解决第一个问题1的最佳工具。或者,可以采用体细胞转因。在这种情况下,转基因通过电穿孔2或病毒转导3传递。接下来,它被保留为表皮体(例如,在标准电穿孔4)或它集成到基因组(随机,通过逆转录病毒整合5;或在一个定义的位置,通过CRISPR促进的同源重组(SLENDR)6).
其次,神经元轮廓可视化可以通过 (a) 稀疏均匀标记或 (b) 密集差分标记来实现。至于稀疏标记,先进的高尔基样方法可采用7种,选定的神经元小组可以由生物细胞蛋白8填充,而盐和胡椒标签可以通过稀疏表达的转基因获得。这种转基因可能显示变异转录(Thy-EGFP)9,或者可以通过随机重组(MORF)10激活。 至于(b),最先进的策略包括多絮荧光蛋白转基因阵列(Brainbow)11中的Cre介导随机重组,以及以前由猪Bac-转位酶驱动的荧蛋白基因基因组整合通过体细胞转发生(CLoNE)12.
至于第三个问题,形态学结果往往受到来自动物间差异和细胞注射意外性的巨大随机变异的影响。因此,通常使用大量的动物来达到评估GOI形态活动所需的统计能力。
前面提到的方法往往依靠先进的技术技能,需要明显的财政资源,这可能限制它们在科学界的传播。为了规避这些问题,我们设想了一个简单明了的管道,以快速、经济的方式解剖体内神经结构的基因控制。其灵感来自于以前为快速体内评估抗冲击转基因活性13而开发的类似联合移植设计。
具体来说,人们认为,将体外工程”绿色”神经前体(“测试”和”控制”细胞)共同移植到”黑色”受体新生儿大脑中可以同时解决上述三个关键问题。事实上,前体的体外慢病毒工程,在控制良好的条件下,允许保持神经元转基因表达的可变性至少,远远低于通常与体内体细胞操作(以前执行14,15和我们未发布的结果)。由此产生的基因表达的准确控制与tt控制的转基因模型相比。然而,这个程序的成本远远低于那些源于转基因小鼠生产线的维护。其次,手部细胞注射很容易,需要最少的训练。此外,可以很方便地调整注入每个大脑的标记前体的数量,以达到足够多分布的前体累积数量,同时将移植动物的总数保持在最低限度。最后但并非最不重要的,共同注射不同含氟标记的”测试”和”控制”前体,以及随后对结果的成对统计分析,抵消了动物间实验变异性的影响,使统计意义的结果,即使分析人数有限的个人13。
应该强调的是,这种方法虽然快速而便宜,但主要有两个局限性。首先,它旨在研究神经元结构的细胞自主基因控制,并不适合解决环境控制问题。其次,当移植的神经元前体通过异形时间安排到达其最终位置时,这种方法比模型神经架构控制更可取。
Protocol
Representative Results
Discussion
此过程的特定方面/步骤至关重要,需要特别注意。首先,(a) 操作员必须经过充分的预训练,才能在符合 BSL-2 标准的实验室环境中安全地操作慢病毒。其次,(b)在混合”测试”和”控制”神经制剂之前,必须按所述仔细清洗两个相应的神经圈悬浮液,以防止由于不需要的慢病毒引起的任何延迟交叉感染。进行。第三,(c)移植细胞时,在瞄准心室腔时必须进行护理;在这方面,快速绿色示踪剂包含在细胞悬浮液是实质?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢米恩·杜克·多为早日建立这一程序所作的贡献。
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
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