Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies
Summary
Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von “Test”- und “Kontrollderivaten” ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.
Abstract
Die Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur wird derzeit intensiv untersucht. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um die in vivo Genkontrolle der neokortikalen Projektionsneuronenmorphologie zu untersuchen. Diese Methode basiert auf (1) in vitro lentiviralen Engineering sernischen Vorläufern als “Test”- und “Kontrollzellen”, (2) ihrer Co-Transplantation in Wild-Gehirne und (3) gepaarter morphometrischer Auswertung ihrer neuronalen Derivate. Konkret werden dafür E12.5 palliale Vorläufer von panneuronalen, genetisch gekennzeichneten Spendern eingesetzt. Sie sind so konzipiert, dass sie ausgewählte Promotoren und tetON/OFF-Technologie nutzen, und sie werden freihändig in neonatale Querventrikel transplantiert. Später, nach der Immunfluoreszenzprofilierung von Empfängergehirnen, werden Silhouetten transplantierter Neuronen in NeurphologyJ Open Source Software eingespeist, ihre morphometrischen Parameter extrahiert und die durchschnittliche Länge und der Verzweigungsindex berechnet. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet diese drei Hauptvorteile: Sie ermöglicht die Erzielung einer feinen Kontrolle der Transgenexpression zu erschwinglichen Kosten, sie erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten und liefert statistisch zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse einer begrenzten Anzahl der Tiere. Aufgrund seines Designs reicht es jedoch nicht aus, die nicht zellautonome Kontrolle der Neuroarchitektur zu adressieren. Darüber hinaus sollte es vorzugsweise verwendet werden, um die Kontrolle der Neuritenmorphologie nach Abschluss der neuronalen Migration zu untersuchen. In ihrer gegenwärtigen Formulierung ist diese Methode exquisit abgestimmt, um die Genkontrolle der glutamatergen neokortikalen Neuronenarchitektur zu untersuchen. Unter Ausnutzung transgener Linien, die EGFP in anderen spezifischen neuronalen Zelltypen exemiten, kann es umfunktioniert werden, um die Genkontrolle ihrer Architektur zu adressieren.
Introduction
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die wir entwickelt haben, um die in vivo Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur zu sezieren. Basierend auf in vitro Engineering von neuronalen Vorläufern, ihre Transplantation in neonatale Gehirn und gepaart morphometrische Bewertung von “Test” und “Kontroll” Zellen, ermöglicht es, funktionelle Auswirkungen von Testgenen in der feinen Kontrolle der neuronalen Morphologie in einem schnell und erschwinglich. Um die In-vivo-Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, müssen drei wichtige technische Fragen angegangen werden: (1) Die Erreichung einer angemessen gemusterten Gen-of-Interest-Expression (GOI) und eine genaue quantitative Kontrolle dieser Expression; (2) Eine korrekt segmentierte Visualisierung unterschiedlicher neuronaler Silhouetten zu erhalten; (3) Statistische Signifikanz der Ergebnisse bei der Verwendung einer begrenzten Anzahl von Tieren.
Wenn verfügbar, können Maus-Mutantenlinien, die Tetracyclin (tet)-gesteuerte Transgene beherbergen, das beste Werkzeug sein, um das erste Problem zu beheben1. Alternativ kann eine somatische Transgenese eingesetzt werden. In solchen Fällen wird das Transgen über Elektroporation2 oder virale Transduktion3geliefert. Als nächstes wird es als Episom (z.B. bei Standardelektroporation4) beibehalten oder in das Genom integriert (zufällig über retrovirale Integrase5; oder an einem definierten Ort, über CRISPR-geförderte homologe Rekombination (SLENDR)6 ).
Zweitens kann die neuronale Silhouettenvisualisierung durch (a) eine spärliche einheitliche Kennzeichnung oder (b) dichte Differentialbeschriftung erreicht werden. Wie für die spärliche Etikettierung können fortschrittliche Golgi-ähnliche Methoden verwendet werden7, ausgewählte neuronale Minisets können mit Biocytin8gefüllt werden, und Salz-und-Pfeffer-Etikettierung kann dank einer spärlich exprimierenden Transgene erhalten werden. Ein solches Transgen kann eine bunte Transkription (Thy-EGFP)9 aufweisen oder durch stochastische Rekombination (MORF) aktiviert werden10. Was (b) betrifft, so umfassen die modernsten Strategien die cre-vermittelte stochastische Rekombination innerhalb eines multi-floxierten Fluorprotein-Transgen-Arrays (Brainbow)11, sowie die piggyBac-transposase-getriebene genomische Integration von Fluorproteingenen, über somatische Transgenese (CLoNE)12geliefert.
Was die dritte Ausgabe betrifft, so wird das morphometrische Ergebnis häufig durch eine große zufällige Variabilität beeinflusst, die auf Unterschiede zwischen den Tieren und Zellinjektionskontingenten beruht. Aus diesem Grund wird in der Regel eine große Anzahl von Tieren eingesetzt, um die statistische Leistung zu erreichen, die für die Bewertung der morphometrischen Aktivität der ausländischen Aktivitäten erforderlich ist.
Die zuvor beschriebenen Ansätze beruhen häufig auf fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten und erfordern auffällige finanzielle Ressourcen, die ihre Verbreitung innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft einschränken können. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine einfache und einfache Pipeline konzipiert, um die Genkontrolle der Neuroarchitektur in vivo schnell und erschwinglich zu sezieren. Dies ist inspiriert von einem ähnlichen Co-Transplantations-Design, das zuvor für die schnelle in vivo-Bewertung der antiblastischen Transgenaktivität13entwickelt wurde.
Insbesondere wird angenommen, dass die Co-Transplantation von in vitro entwickelten “grünen” neuronalen Vorläufern (“Test”- und “Kontrollzellen”) in ein “schwarzes” neonatales Gehirn gleichzeitig die drei oben aufgeführten Schlüsselprobleme beheben kann. Tatsächlich ermöglicht die in vitro lentivirale Entwicklung von Vorläufern unter gut kontrollierten Bedingungen die Aufrechterhaltung der Variabilität der neuronalen Transgenexpression auf ein Minimum, weit unter dem, das normalerweise mit in vivo somatischen Manipulationen verbunden ist (zuvor durchgeführt 14 , 15 und in unseren unveröffentlichten Ergebnissen). Die daraus resultierende genaue Kontrolle der Genexpression ist vergleichbar mit der von tet-kontrollierten transgenen Modellen. Die Kosten dieses Verfahrens liegen jedoch weit unter denen, die aus der Wartung einer transgenen Mauslinie stammen. Als nächstes ist die Freihandinjektion einfach und erfordert minimales Training. Darüber hinaus kann die Menge der in jedes Gehirn injizierten markierten Vorläufer leicht darauf abgestimmt werden, eine ausreichende kumulative Anzahl von dünn verteilten Vorläufern zu erreichen, während gleichzeitig die Gesamtzahl der transplantierten Tiere auf ein Minimum beschränkt bleibt. Last but not least wirken die Co-Injektion unterschiedlich fluormarkierter, “test” und “kontrollierter” Vorläufer und die anschließende paarweise statistische Analyse der Ergebnisse den Auswirkungen der versuchsweisen Variabilität zwischen Dentieren entgegen, die das Erreichen von statistische Signifikanz der Ergebnisse, auch nach der Analyse einer begrenzten Anzahl von Personen13.
Es sollte betont werden, dass diese Methode, wenn auch schnell und billig, zwei Hauptbeschränkungen hat. Erstens wurde es entwickelt, um die zellautonome Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, und es ist nicht angemessen, sich mit der Umweltkontrolle zu befassen. Zweitens ist diese Methode, da transplantierte neuronale Vorläufer durch einen heterochronischen Zeitplan ihren endgültigen Standort erreichen, dem Modell der neuroarchitektonischen Kontrolle nach der Migration vorzuziehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spezifische Aspekte/Schritte dieses Verfahrens sind von entscheidender Bedeutung und erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens müssen (a) die Bediener ausreichend vortrainiert sein, um Lentiviren in einer BSL-2-kompatiblen Laborumgebung sicher zu manipulieren. Zweitens, b) vor dem Mischen von “Test” und “Kontrolle” neuronaler Präparate ist es obligatorisch, die beiden entsprechenden Neurosphärensuspensionen wie beschrieben sorgfältig zu waschen, um eine verzögerte Kreuzinfektion der beiden Präparate aufgrund uner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mihn Duc Do für seinen Beitrag zur frühzeitigen Einrichtung dieses Verfahrens.
Materials
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 ℃ |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at +4 ℃ |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 ℃ |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at +4 ℃ |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at +4 ℃ |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | DispoMold07 |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 ℃ |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at +4 ℃ |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at +4 ℃ |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 ℃ |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 ℃ |
| Fine scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 ℃ |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 ℃ |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 ℃ |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at +4 ℃ |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 ℃ |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | store at RT |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | Flaming/Brown Micropipette Puller |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 ℃ |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | ||
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | ||
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | ||
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 ℃ |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at +4 ℃ |
References
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