يتم وصف طريقة أنزيمية فعالة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية الأولية (pAECs) من الخنازير المصغرة. يمكن استخدام pAECs الأولية المعزولة للتحقيق في الاستجابة المناعية والتخثر في الزرع xenotransplant.
Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل النقص في الأعضاء البشرية للمرضى الذين يعانون من فشل الجهاز في المرحلة النهائية، ويعتبر الخنزير كمصدر مناسب للأعضاء. رفض المناعة والتخثر هما عقبتان رئيسيتان لنجاح زرع xenotransplant. إصابة الخلايا البطانية الوعائية (EC) والخلل مهم لتطوير استجابات الالتهاب والتخثر في زرع الأكسي. وهكذا، فإن عزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية (pAECs) ضروري للتحقيق في استجابات الرفض المناعي والتخثر. هنا، قمنا بتطوير نهج أنزيمي بسيط لعزل وتوصيف وتوسيع pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة. أولاً، تم التخدير عن الخنزير المصغر بالكيتامين، وتم استئصال طول الأبهر. ثانيا، تعرض السطح البطانية من الأبهر إلى 0.005٪ كولاجيناز الرابع محلول هضمي لمدة 15 دقيقة، ثالثا، تم كشط سطح بطانة الأبهر في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (<10 مرات)، ولم يتم ضغطها خلال عملية الغاء. وأخيراً، تم تحديد pAECs معزولة من اليوم 3، وبعد مرور 1 والممر 2، عن طريق قياس التدفق مع الأجسام المضادة CD31. وكانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 97.4٪ ± 1.2٪، 94.4٪ ± 1.1٪، و 92.4٪ ± 1.7٪ (يعني ± SD)، على التوالي. تركيز Collagenase الرابع، والوقت الهضمي، واتجاه، وتواتر وكثافة كشط حاسمة لخفض التلوث الليفي والحصول على عالية النقاء وعدد كبير من ECs. في الختام، لدينا طريقة الأنزيمية هي طريقة عالية الفعالية لعزل ECs من الأبهر الخنزير مصغرة، ويمكن توسيع الخلايا في المختبر للتحقيق في استجابات المناعة والتخثر في الزرع xenotransplant.
نقص الأعضاء المتاحة للزرع هو مشكلة المعلقة في جميع أنحاء العالم1. ووفقا لجمعية الصليب الأحمر الصينية، لم يتلق سوى عدد قليل من المرضى الذين يعانون من فشل في الأعضاء في المرحلة النهائية جهازا مناسبا في الصين في عام 2018.
زرع Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل مشكلة نقص الأعضاء. وتعتبر أجهزة الخنزير لتكون الأجهزة الأكثر ملاءمة للبشر بسبب التشابه التشريحي والفيزيولوجي2،3. يرتبط فشل xenograft خنزير إلى حد كبير إلى رفض المناعة الرئيسيات والاستجابات التخثر. الخلايا البطانية البورسينية (ECs) حاسمة لأن هذه الخلايا هي الأولى للتفاعل مع الجهاز المناعي الرئيسي، والذي يتضمن الأجسام المضادة، تكملة، السيتوكينات، والخلايا المناعية (على سبيل المثال، الخلايا T، الخلايا B، والضامة)4،5. Porcine ECs تلعب دورا حيويا في عضو الخنزير وislet xenotransplant6,7. وهكذا، ECs هي خلايا هامة للتحقيق في ردود الرفض والتخثر لطعم الخنزير. مطلوب عزل عالية الجودة من الخنازير ECs لبحوث الزرع xenotransplant.
في محاولات لعزل ECs من أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، القلب والكلى والكبد والأبهر)، تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في إعداد xenotransplant8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الحفاظ على ثقافة فائقة النقاء للمركبات الإلكترونية المعزولة يمثل مشكلة بارزة في البروتوكولات القياسية. زيادة تركيز الحل المهضوم، ووقت الهضم غير المناسب وكثافة كشطقد تسهم في زيادة التلوث الليفي في الدراسات الحالية 8،10،13. إلى جانب ذلك، فإن طريقة pAECs معزولة من الخنازير مصغرة هو أقل دراسة. هنا، نقوم بوصف طريقة أنزيمية محسنة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة (Wuzhishan أو Bama). وقد تم تصميم عدة خطوات في البروتوكول للحد من التلوث الليفي والحصول على ECs عالية النقاء.
وتستخدم الخلايا البطانية عادة في البحوث من خلل الأوعية الدموية, مرض السكري, تجديد الأنسجة, زرع, والسرطانات14,15,16,17,18. لفهم وتوصيف البيولوجيا ووظيفة ECs في هذه الأمراض، تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لعزل E…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: 2016A030313028؛ مؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: B2018003؛ مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا، منحة / رقم الجائزة: JCYJ20180306172449376، JCYJ20180306172459580, JCJY20202920484975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 و JCYJ201604288142040404045; شنتشن لونغهوا منطقة مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، منحة / جائزة رقم: 2017013؛ البرنامج الوطني لمفاتيح R&D في الصين، منحة / جائزة رقم: 2017YFC1103704؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن، منحة / جائزة رقم: SZSM201412020؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)؛ صندوق للانضباط الطبي العالي المستوى بناء شنتشن، منحة / جائزة رقم: 2016031638؛ مؤسسة شنتشن للصحة وتنظيم الأسرة لجنة، منحة / جائزة رقم: SZXJ2017021 وSZXJ2018059. نشكر هانتشنغ تشانغ وزيتشنغ زو من جامعة شنتشن على مساعدتهما فى اعداد المخطوطة .
BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
Cell scraper | Corning | 3010# | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride:0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride:1mg/2ml | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
ECM | Sciencell | 1001# | |
ECGS | Sciencell | 1052# | |
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
Flowjo v10.0 | |||
Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap (T25) | Corning | 3289# | |
Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
Syringe(5mL) | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |