ミニチュアブタからの原発性大動脈内皮細胞の単離と培養
1Department of Nephrology,Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center,Shenzhen Second People’s Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory,Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology,Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery,University of Alabama at Birmingham, 6People’s Hospital of Longhua
Summary
小型ブタから原発性ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)を単離するための有効な酵素法が記載されている。単離された一次pAECは、xeno移植における免疫および凝固応答を調べるために使用することができる。
Abstract
Xeno移植は、末期臓器不全患者のヒト臓器不足を解決する有望な方法であり、ブタは適切な臓器源と考えられている。免疫拒絶反応と凝固は、xeno移植の成功のための2つの主要なハードルです。血管内皮細胞(EC)損傷および機能不全は、xeno移植における炎症および凝固応答の発症にとって重要である。したがって、ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)の単離は、免疫拒絶反応および凝固応答を調べるための必要がある。ここでは、小型ブタから高精製されたpAECの分離、特性評価、拡大のためのシンプルな酵素アプローチを開発しました。まず、小型豚をケタミンで麻酔し、大腸の長さを取り除いた。第二に、大動脈の内皮表面を0.005%コラゲナーゼIV消化液に15分間曝露し、大動脈の内皮表面を細胞スクレーパー(<10回)で一方向にのみ削り取り、その過程で圧縮されなかった。こする。最後に、3日目の単離されたpAECを、および通路1および通路2の後に、抗CD31抗体を用いたフローサイトメトリーにより同定した。CD31陽性細胞の割合は、それぞれ97.4%±1.2%、94.4%±1.1%、92.4%±1.7%(平均±SD)であった。コラゲナーゼIVの濃度、消化時間、方向、スクレイピングの頻度と強度は、線維芽細胞汚染を減少させ、高純度および多数のICを得るために重要です。結論として、我々の酵素法は、小型ブタ大脳からICを分離するための非常に効果的な方法であり、細胞を体積して異種移植における免疫および凝固応答を調べることができます。
Introduction
移植のための利用可能な臓器の不足は、世界的に顕著な問題です1.中国赤十字社によると、2018年に中国で末期臓器不全を起えた患者はごくわずかです。
Xeno移植は、臓器不足の問題を解決するための有望な方法です。豚の臓器は、解剖学的および生理学的類似性2、3のために人間に最も適した器官であると考えられている。ブタ異種移植片の不全は、霊長類の免疫拒絶反応および凝固応答に大きく関連している。これらの細胞は、抗体、補体、サイトカイン、および免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、およびマクロファージ)を含む霊長類免疫系と相互作用する最初の細胞であるため、ブタ内皮細胞(IC)は重要である4、5。ブタのICはブタの臓器およびイレットの細胞移植6、7で重要な役割を果たしている。したがって、ICは、ブタ移植片に対する拒絶反応および凝固応答を調出するための重要な細胞である。xeno移植研究には高品質のブタICの分離が必要です。
異なる臓器(例えば、心臓、腎臓、肝臓および大腸)からICを分離する試みにおいて、いくつかのプロトコルは、異種移植設定8、9、10、11、12で報告されている。しかし、分離されたICの超純粋な文化を維持することは、標準プロトコルでは顕著な問題です。消化溶液の濃度の増加は、不適切な消化時間および擦り傷強度が、現在の研究8、10、13における線維芽細胞汚染の増加に寄与しうる。また、小型ブタからpAECを単離する方法はあまり研究されていない。ここでは、精製性の高いpAICを小型ブタ(無気力またはバマ)から分離するための最適化された酵素法について説明する。プロトコルのいくつかのステップは、線維芽細胞汚染を低減し、高純度のICを得るように設計されています。
Protocol
動物の使用は、動物福祉の原則に従って、深セン第二人民病院の倫理審査委員会によって承認されました。 1. 動物、培地、バッファーの調製 ミニチュアブタを準備します。注:すべてのミニチュアブタは、中国のムジシャンまたはバマ豚(雄)でした。ブタの年齢及び重量は、それぞれ100日±8日及び5.7kg±1.0kg(平均±SD、n=3)であった。 培養培地を調製する:?…
Representative Results
この方法は、高精製されたICを小型ブタから大口から分離する効果的な方法を提供することを目的としています。大横手術の過程を図1に示す。最初のステップは、大小全部が豚から取り除かれることです。他の細胞や細菌の汚染を防ぐことは非常に重要です。したがって、標的化されていない細胞や細菌が大腸を汚染した場合に他の器官や組織を傷つけないようにし、?…
Discussion
内皮細胞は、血管機能障害、糖尿病、組織再生、移植、および癌14、15、16、17、18の研究で一般的に使用される。これらの疾患におけるICの生物学と機能を理解し特徴付けるために、異なる疾患の臓器や組織のICを単離する多数の方法が報告されている8,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、広東省自然科学財団の助成金、助成金/賞番号:2016A030313028の助成金によって支援されました。広東省医学科学研究財団, 助成金/賞番号: B2018003;深セン科学技術振興財団、助成金/賞番号:JCYJ20180306172449376、 JCYJ20180306172459580、JCJY2016029204849975、GJHZ201703141713575556、JCYJ2016042151030000110300001とJCYJ20101000011000001深センロンフア地区科学技術財団、助成金/賞番号:2017013;中国国家主要研究開発プログラム、助成金/賞番号:2017YFC1103704;深センの医学のサンミンプロジェクト, 助成金/賞番号: SZSM201412020;広東省の高レベル病院建設特別基金(2019年)深センの高レベル医療規律建設基金,助成金/賞番号: 2016031638;深セン健康・家族計画委員会、助成金/賞番号:SZXJ2017021およびSZXJ2018059。我々は、原稿の準備を支援してくれた深セン大学のハンチェン・ジャンとZhicheng Zouに感謝する。
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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Cite This Article
Zhao, Y., Zhao, C., Cooper, D. K., Lu, Y., Luo, K., Wang, H., Chen, P., Zeng, C., Luan, S., Mou, L., Gao, H. Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (150), e59673, doi:10.3791/59673 (2019).