בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים
Summary
שיטת אנזימטית אפקטיבית לבידוד של תאי האבי-העורקים הראשוניים של החזיר (pAECs) מחזירים זעירים מתוארים. PAECs העיקרי מבודד ניתן להשתמש כדי לחקור את התגובה החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.
Abstract
Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את המחסור של איברי האדם עבור חולים עם כשל איבר בשלב הסופי, והחזיר נחשב מקור איבר מתאים. דחייה וקרישה החיסונית הם שני מכשולים עיקריים להצלחת השתלת xenotransplantation הפציעה והתפקוד הגופני של כלי הדם (EC) הם חשובים לפיתוח התגובה לדלקות וקרישת דם ב-xenotransplantation שתלת. כך, בידוד של התאים החיוניים של האבי העורקים (pAECs) יש צורך לחקור את הדחייה החיסונית ואת התגובות קרישת דם. כאן פיתחנו גישה אנזימטית פשוטה לבידוד, אפיון והתרחבות של pAECs מטוהרים מאוד מחזירים זעירים. , החזיר הזעיר הרדימים עם קטמין. ואורך של העורקים היה מגורש שנית, משטח האנדותל של העורקים נחשף 0.005% הפתרון העיכול IV הרביעי עבור 15 דקות. השלישי, משטח האנדותל של העורקים היה מגורד בכיוון אחד בלבד עם מגרד תא (< 10 פעמים), ולא נדחס במהלך התהליך של גירוד. בסופו של דבר, pAECs מבודדים של היום 3, ואחרי מעבר 1 ומעבר 2, זוהו על ידי cy, הזרמת לנסות עם נוגדן anti-CD31. האחוזים של תאים CD31-חיוביים היו 97.4% ± 1.2%, 94.4% ± 1.1%, ו 92.4% ± 1.7% (ממוצע ± SD), בהתאמה. הריכוז של קולגן הרביעי, זמן העיכול, את הכיוון, ואת התדר ואת העוצמה של גירוד הם קריטיים להפחתת זיהום בפיברובלסט וקבלת טוהר גבוהה ומספר רב של ECs. לסיכום, השיטה האנזימטית שלנו היא שיטה מeffctive ביותר לבידוד ECs מן העורקים חזיר מיניאטורי, ואת התאים ניתן להרחיב בתוך מבחנה כדי לחקור את התגובות החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.
Introduction
המחסור של איברים זמינים עבור השתלת הוא בעיה מצטיינים ברחבי העולם1. על פי החברה הצולבת האדומה של סין, רק מספר קטן של חולים עם כשל איברים בשלב הסיום קיבל איבר מתאים בסין בשנת 2018.
Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את הבעיה של מחסור באיברים. איברי חזיר נחשבים לאיברים המתאימים ביותר עבור בני אדם בגלל דמיון אנטומי ופיזיולוגי2,3. הכישלון של שהשתיל חזיר מבע ברובו לדחיית החיסון הקופים התגובות קרישת דם. תאים של porcine אנדותל (ecs) הם קריטיים מאז תאים אלה הם הראשונים אינטראקציה עם המערכת החיסונית של הפרימטים, הכוללת נוגדן, משלים, ציטוקינים, ותאים חיסוניים (למשל, T תאים, B תאים, מקרופאגים)4,5. המשחק ecs לשחק תפקיד חיוני באורגן חזיר ו השתלת איון xenotransplantation,7. כך, ECs הם תאים חשובים לחקירת דחייה והתגובות קרישת הדם שתל חזיר. בידוד של ECs באיכות גבוהה נדרש עבור מחקר xenotransplantation שתלת.
בניסיונות לבודד ecs מאיברים שונים (למשל, לב, כליות, כבד, העורקים), כמה פרוטוקולים דווחו בהגדרה xenotransplant שתלה8,9,10,11,12. עם זאת, שמירה על תרבות אולטרה-סאונד של ECs מבודדת היא בעיה יוצאת דופן בפרוטוקולים הסטנדרטיים. הריכוז המוגבר של הפתרון המתעכל, זמן העיכול הבלתי מתאים ועוצמת הגרד עשויה לתרום לזיהום פיברובסט מוגבר במחקרים הנוכחיים8,10,13. חוץ מזה, השיטה של pAECs מבודדים מחזירים זעירים הוא פחות לומד. כאן, אנו מתארים שיטה אנזימטית אופטימיזציה כדי לבודד pAECs מטוהרים מאוד מפני חזירים זעירים (וודז’שאן או במה). כמה צעדים בפרוטוקול נועדו להפחית את זיהום הפיברובלסט ולהשיג ECs טוהר גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי האנדותל משמשים בדרך כלל במחקר של תפקוד כלי דם, סוכרת, התחדשות רקמות, השתלת, סרטן14,15,16,17,18. כדי להבין ולאפיין את הביולוגיה ואת התפקוד של ecs במחלות אלה, שיטות רבות כדי לבודד ecs של איברים חולים שונים או ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הטבעי של מחוז גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: 2016A030313028; הקרן המדעית למחקר רפואי של פרובינציית גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: B2018003; קרן שנזן למדע וטכנולוגיה, מספר גרנט/פרס: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 וJCYJ20160428142040945; הקרן למדע וטכנולוגיה של שנג לונחואה, הענקת מספר פרס: 2017013; מפתח לאומי R & D תוכנית של סין, גרנט/מספר הפרס: 2017YFC1103704; פרויקט sanming של הרפואה שנזן, גרנט/מספר הפרס: SZSM201412020; קרנות מיוחדות להקמת בתי חולים ברמה גבוהה בפרובינצית גואנג-דונג (2019); קרן ברמה גבוהה משמעת רפואית בנייה של שנג, גרנט/מספר הפרס: 2016031638; קרן שנזן בריאות ותכנון משפחה הנציבות, גרנט/מספר הפרס: SZXJ2017021 ו SZXJ2018059. אנו מודים לחננג ג’אנג ולדז’נג זיאו מאוניברסיטת שנזן לסיוע בהכנת כתב היד.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. 生物化学. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
