כפול-עכברים הומניזציה מודל שמציעות מיקרובידום יציבה אנושית כמו בטן האדם המערכת החיסונית
Summary
אנו מתארים שיטה הרומן ליצירת הומניזציה כפולה עכברים התכונה המערכת החיסונית האנושית תפקודית יציבה מנופה של בני אדם כמו מיקרובידום. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה ללא צורך בעכברים ללא חיידקים או מתקני גנוטוביוטיקה.
Abstract
עכברים הומניזציה (hu-עכברים) התכונה מערכת חיסונית אנושית תפקודית שינתה באופן מהותי את המחקר של פתוגנים אנושיים ומחלות. הם יכולים לשמש כדי לדגמן מחלות כי הם קשים אחרת או בלתי אפשרי ללמוד בבני אדם או דגמי בעלי חיים אחרים. המעיים יכולים להשפיע עמוקות על בריאות האדם ועל המחלה. עם זאת, מיקרובידום בטן מורלין שונה מאוד מזו שנמצאה אצל בני האדם. יש צורך שיפור מודלים פרה-קליניים הקדם-קליני כי יש חרט מיקרובידום במעיים אנושיים. לכן, יצרנו כפול-עכברים הכוללים גם מערכת חיסונית אנושית ויציבה של מיקרובידום בטן אנושיים. תהנהן. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg) עכברים הם אחד החיות הטובות ביותר עבור הומניזציה בשל הרמה הגבוהה שלהם של הכשל החיסוני. עם זאת, חיידקים NSG ללא נבט, ומודלים שונים חשובים אחרים חיידקים שאינם מסחרית כרגע זמין. יתר על כן, הגדרות מחקר רבות אין גישה למתקני גנוביוטיקה, ועבודה תחת תנאים גנוביוטיים יכול להיות לעתים קרובות יקר זמן רב. וחשוב מכך, עכברים ללא חיידקים יש כמה ליקויים חיסוניים שקיימים גם לאחר החרט של חיידקים. לכן, פיתחנו פרוטוקול שאינו דורש בעלי חיים ללא חיידקים או מתקני גנוביוטיקה. כדי לייצר כפול-עכברים, עכברים NSG טופלו בקרינה לפני ניתוח כדי ליצור מח עצם, כבד, בלוטת התימוס-הומניזציה (hu-בייקון) עכברים. העכברים טופלו לאחר מכן עם אנטיביוטיקה ספקטרום רחב כדי לרוקן את מיקרובידום הבטן מורטין הקיים מראש. לאחר טיפול אנטיביוטי, העכברים ניתנו השתלות צואה עם דגימות של תורם אנושי בריא באמצעות gavage אוראלי. העכבר כפול-הייקון היו פרופילי הגנים הייחודיים של 16S rRNA מבוסס על מדגם התורם האנושי היחיד שהיה מושתל. חשוב מכך, המושתלת האדם כמו microbiome היה יציב בעכברים הכפול hu-בייקון למשך המחקר עד 14.5 שבועות לאחר ההשתלה.
Introduction
עכברים הומניזציה (hu-עכברים) הפכו את המחקר של היבטים רבים של בריאות האדם ומחלות כולל המטפיאה, חסינות, סרטן, מחלות אוטואימוניות, מחלה זיהומית1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. אלה-עכברים הם בעלי יתרון ברור על פני מודלים אחרים של העכבר כי יש להם מערכת פונקציונלית האדם החיסונית יכול להיות נגוע פתוגנים ספציפיים אנושיים. עם זאת, החשיבות של מיקרובידום בטן הפגינו על ידי תפקידה במחלות אנושיות רבות כגון השמנה, תסמונת מטבולית, מחלות דלקתיות, סרטן10,11,12, . שלוש עשרה המערכת החיסונית רירית ואת המעיים מיקרובידום הם הופמוטיות לשמור על בטן והומאוסטזיס מערכתית. המערכת החיסונית מעוצבת על ידי אנטיגנים המוצגים על ידי מיקרובידום המעיים ההופקלי המערכת החיסונית ממלא תפקיד רגולציה חשוב בקידום חיידקים המעיים המנוע וסילוק פתוגנים14,15, 16. עם זאת, מיקרובידום הבטן של הו-עכברים לא היה מאופיין היטב, מיקרובידום בטן murine שונה באופן משמעותי בקומפוזיציה ותפקוד מבני אדם17. זאת בשל הבדלים אבולוציוניים, פיזיולוגיים, ואנטומיים בין המורין לבטן האדם, כמו גם גורמים חשובים אחרים כגון דיאטה, אשר עשויים להשפיע על התוצאות הנסיוניות של מחלת hu-עכברים18. לכן, מעבר לסיווג של מיקרובידום בטן מורלין של hu-עכברים, מודל בעלי חיים הכולל הן מערכת חיסונית אנושית ומיקרובידום הבטן האנושית נחוצה כדי ללמוד את האינטראקציות המורכבות של מחלות אנושיות בvivo.
חקר המחלות האנושיות ישירות במקצועות האדם הוא לעתים קרובות לא מעשי או לא מוסרי. מודלים בעלי חיים רבים לא ניתן להשתמש כדי ללמוד פתוגנים אנושיים כמו וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1). מודלים של פרימטים לא אנושיים הם מחוץ גנטית, יקר מאוד, ואינם חשופים לפתוגנים אנושיים רבים. עכברים שנגזרו כמו נבט חינם (GF) ו מחדש עם האדם כמו בטן microbiomes שימשו רבות כדי ללמוד בריאות האדם מחלה19,20. עם זאת, בעלי חיים אלה אין מערכת חיסונית אנושית ועבודה עם בעלי חיים GF דורש מתקנים מיוחדים, הליכים, ומומחיות. לכן, יש צורך שיפור מודלים טרום קליניים כדי ללמוד את הקשר המורכב של המעיים מיקרובידום ואת המערכת החיסונית האנושית. זנים רבים של עכברים, כגון נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg), אינם זמינים מסחרית כ-GF. בעלי חיים GF עלולים לסבול מליקויים חיסוניים ארוכי טווח שאינם מפוכים לחלוטין על ידי החרט של חיידקים21. לכן, יצרנו כפול העכברים שמציעות הן מערכת החיסון האנושי תפקודית מיקרובידום הבטן האנושי כמו המעיים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן (SPF). כדי ליצור כפול הו-עכברים, הניתוח בוצע על עכברים NSG כדי ליצור מח עצם, הכבד, עכברים הומניזציה של התימוס (hu-בייקון). העכברים של הו-בייקון טופלו לאחר מכן עם אנטיביוטיקה ספקטרום רחב ולאחר מכן נתן השתלות צואה עם דגימת תורם אנושי בריא. אנו מאופיינים את הבטן בקטריאלי מיקרובידום של 173 דגימות צואה מ 45 כפול השני עכברים ו 4 דגימות בצואה אדם התורם. עכברים כפול הייקון יש פרופילי הגנים הייחודיים של 16S rRNA מבוסס על מדגם התורם האנושי היחיד כי הוא מושתל. חשוב מכך, המושתלת האדם כמו microbiome היה יציב בעכברים למשך המחקר עד 14.5 שבועות לאחר ההשתלה. בנוסף, metagenomes החזוי הראו שלעכברים כפולים בעלי יכולת פונקציונלית שונה מאשר עכברים שדומים יותר לדגימות התורמות האנושיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא ליצירת עכברים כפול-בייקון התכונה הן המערכת החיסונית האנושית תפקודית ויציבה אנושי כמו בטן microbiome. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למודלים אחרים של עכברים או שאינם הומניזציה ללא צורך בעלי חיים GF ומתקני גנוביוטיקה. בעוד שהשיטות המתוארות כאן הן פשוטות יחסית, קיימות מספר …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות ליאנמין וואן, לגוקובין קאנג, ולפלאבי קונדו לעזרתם ביצירת עכברים הוממיזציה. היינו רוצים להכיר את UNMC מתקן ליבה גנומיקה אשר מקבל תמיכה חלקית מרשת מחקר נברסקה ב גנומיקה תפקודית NE-INBRE P20GM103427-14, הביולוגיה המולקולרית של מערכות נוירוחושי CoBRE P30GM110768, פרד & פמלה מרכז הסרטן באפט-P30CA036727, המרכז של שורש ו ריזובידום חדשנות (CRRI) 36-5150-2085-20, ואת היוזמה נברסקה מחקר. אנחנו רוצים להודות לאוניברסיטת נברסקה-באגף מדעי החיים לינקולן הצוות שלהם על עזרתם. מחקר זה נתמך בחלק על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 כרונית נגיף ההזדקנות במרכז neuroaids (שרשרת), 1R01AI111862 ל Q לי. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, הכנת כתב היד או ההחלטה לפרסום.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
