Двойная гуманизированная модель BLT-mice с стабильным микробиомом кишки человека и иммунной системой человека
Summary
Мы описываем новый метод генерации двойных гуманизированных BLT-мышей, которые имеют функциональную иммунную систему человека и стабильный привитый человекоподобный микрофлора кишечника. Этот протокол может быть соблюден без необходимости для зародышевых мышей или гноотобиотических объектов.
Abstract
Гуманизированные мыши (ху-мышей), которые имеют функциональную иммунную систему человека, коренным образом изменили изучение патогенов и болезней человека. Они могут быть использованы для моделирования заболеваний, которые в противном случае трудно или невозможно изучить в организме человека или других моделей животных. Микробиом кишечника может оказывать глубокое воздействие на здоровье и болезни человека. Тем не менее, микрофлора кишечника мурин сильно отличается от того, что содержится в организме человека. Существует необходимость в улучшении доклинических моделей ху-мышей, которые привиты ху-мышей микробиома. Таким образом, мы создали двойных ху-мышей, которые имеют как иммунную систему человека и стабильный человекоподобный микрофлора кишечника. Кивок. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) мыши являются одними из лучших животных для гуманизации из-за их высокого уровня иммунодефицита. Тем не менее, зародыш-свободно мышей NSG, и различные другие важные зародышевые-свободные модели мышей в настоящее время коммерчески не доступны. Кроме того, многие исследовательские настройки не имеют доступа к гнотобиотические средства, и работа в гнотобиоических условиях часто может быть дорогим и трудоемким. Важно отметить, что без микробов мышей имеют несколько иммунных недостатков, которые существуют даже после прививки микробов. Поэтому мы разработали протокол, который не требует микробов животных или гноотобиотических объектов. Для создания двойных ху-мышей, NSG мышей лечили с радиацией до операции по созданию костного мозга, печени, тимуса-гуманизированных (hu-BLT) мышей. Мышей затем лечили антибиотиками широкого спектра, чтобы истощить уже существующий микрофлору кишечника мурина. После лечения антибиотиками, мышей были даны фекальные трансплантации со здоровыми человеческими образцами донора через устные gavage. Двойные мыши hu-BLT имели уникально профили гена 16S rRNA основанные на индивидуальном людском образце дарителя который был трансплантирован. Важно отметить, что пересаженный человекоподобный микробиом был стабильным в двойных мышах hu-BLT в течение всего периода исследования до 14,5 недель после трансплантации.
Introduction
Гуманизированные мыши (ху-мышей) изменили изучение многих аспектов здоровья человека и болезней, включая гематопоезии, иммунитет, рак, аутоиммунные заболевания, и инфекционные заболевания1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Эти ху-мышей имеют явное преимущество по сравнению с другими моделями мыши в том, что они имеют функциональную иммунную систему человека и могут быть инфицированы человеческими конкретными патогенами. Тем не менее, важность микрофлоры кишечника была продемонстрирована его роль во многих человеческих заболеваний, таких как ожирение, метаболический синдром, воспалительные заболевания, и рак10,11,12, 13. Слизистая иммунная система и микрофлора кишечника взаимно регулируются для поддержания кишечника и системного гомеостаза. Иммунная система формируется антигенов, представленных микрофлоры кишечника и взаимно иммунная система играет важную регулятивную роль в содействии сопутствующих бактерий кишечника и ликвидации патогенов14,15, 16. Однако, микрофлора кишечника hu-mice не была наилучшим образом охарактеризована и микробиом кишки murine отличает существенн в составе и функции от людей17. Это связано с эволюционными, физиологическими и анатомическими различиями между мурином и кишечником человека, а также другими важными факторами, такими как диета, которые могут влиять на экспериментальные результаты моделей болезни ху-мышей18. Таким образом, помимо классификации микрофлоры кишечника мурин ху-мышей, для изучения сложных взаимодействий болезни человека in vivo необходима модель животного происхождения, включающая как иммунную систему человека, так и микробиом кишечника человека.
Изучение заболеваний человека непосредственно у людей часто непрактично или неэтично. Многие модели животных не могут быть использованы для изучения человеческих патогенов, таких как вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Нечеловеческие модели приматов генетически выведены, очень дороги и не подвержены многим патогенам человека. Мыши, которые были получены как микроб бесплатно (GF) и восстановлены с человеком, как кишечные микробиомы были широко использованы для изучения здоровья человека и болезни19,20. Тем не менее, эти животные не имеют иммунной системы человека и работы с GF животных требует специализированных средств, процедур и опыта. Поэтому необходимо улучшить доклинические модели для изучения сложной взаимосвязи микрофлоры кишечника и иммунной системы человека. Многие штаммы мышей, такие как NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), не являются коммерчески доступными как GF. GF животных также могут страдать от длительных иммунных недостатков, которые не полностью отменены прививки микробов21. Таким образом, мы создали двойной ху-мышей с участием как функциональной иммунной системы человека и стабильного человека, как кишечный микробиом в конкретных патогенов свободных (SPF) условиях. Для создания двойных ху-мышей, операция была проведена на мышах NSG для создания костного мозга, печени, тимуса гуманизированных мышей (hu-BLT). Hu-BLT мышей затем лечили с широким спектром антибиотиков, а затем с учетом фекальных трансплантаций со здоровым образцом донора человека. Мы охарактеризовали бактериальный микрофлорный микрофлору 173 фекальных образцов из 45 двойных мышей hu-BLT и 4 образцов человеческих фекальных доноров. Двойные мыши hu-BLT имеют уникальные профили генов 16S rRNA на основе индивидуального образца донора человека, который пересаживается. Важно отметить, что пересаженный человекоподобный микробиом был стабильным у мышей в течение всего периода после трансплантации до 14,5 недель. Кроме того, прогнозируемые метагеномы показали, что двойные мыши hu-BLT имеют различные прогнозируемые функциональные возможности, чем ху-мышей, которые больше похожи на образцы доноров человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол предназначен для создания двойных мышей hu-BLT, которые имеют как функциональную иммунную систему человека, так и стабильный микрофлору кишечника, похожий на человека. Этот протокол может быть адаптирован к другим гуманизированным или негуманизированным моделя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Янмин Ван, Гуобин Кан и Паллаби Кунду за их помощь в создании BLT-гуманизированных мышей. Мы хотели бы отметить UNMC Геномика Основной фонд, который получает частичную поддержку от Небраска научно-исследовательской сети в функциональной геномики NE-INBRE P20GM103427-14, Молекулярная биология нейросенсорных систем CoBRE P30GM110768, Фред и Памела Баффет онкологический центр – P30CA036727, Центр корней и Rhizobiome инноваций (CRRI) 36-5150-2085-20, и Небраска исследовательской инициативы. Мы хотели бы поблагодарить Университет штата Небраска – Lincoln Life Sciences Annex и их сотрудников за их помощь. Это исследование частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения (NIH) Гранты R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Хроническая ВИЧ-инфекция и старение в НейроСПИД (CHAIN) Центр, 1R01AI111862 до Ли. Спонсоры не принимали никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, подготовке рукописи или принятии решения для публикации.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
