Um duplo humanizado BLT-MICE modelo caracterizando um estável humano-como o intestino Microbiome e sistema imunológico humano
Summary
Nós descrevemos um método novo para gerar os BLT-ratos humanizados dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como enxertado estável do intestino. Este protocolo pode ser seguido sem a necessidade para ratos germe-livres ou facilidades gnotobióticos.
Abstract
Camundongos humanizados (Hu-camundongos) que apresentam um sistema imunológico humano funcional mudaram fundamentalmente o estudo de patógenos e doenças humanas. Podem ser usados para modelar as doenças que são de outra maneira difíceis ou impossíveis de estudar nos seres humanos ou em outros modelos animais. O microbioma intestinal pode ter um profundo impacto na saúde humana e na doença. No entanto, o microbioma do intestino murino é muito diferente do encontrado em humanos. Há uma necessidade para os modelos pre-clínicos melhorados do Hu-ratos que têm um microbioma humano enxertado do intestino. Conseqüentemente, nós criamos Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imunitário humano e um microbioma humano-como estável do intestino. Aceno. Os camundongos CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) são um dos melhores animais para a humanização devido ao seu alto nível de imunodeficiência. No entanto, camundongos NSG livres de germes e vários outros modelos de camundongos sem germes importantes não estão atualmente disponíveis comercialmente. Além disso, muitas configurações de pesquisa não têm acesso a instalações gnotobióticas, e trabalhar condições gnotobióticas muitas vezes pode ser caro e demorado. Importante, os ratos germe-livres têm diversas deficiências imunes que existem mesmo depois que o Engraftment dos micróbios. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um protocolo que não exija animais germe-livres ou facilidades gnotobióticos. Para gerar ratos Hu-duplos, camundongos NSG foram tratados com radiação antes da cirurgia para criar camundongos de medula óssea, fígado, Thymus-humanizados (Hu-BLT). Os ratos foram tratados então com os antibióticos do espectro largo para esgotar o microbioma murino pre-existing do intestino. Após o tratamento antibiótico, os camundongos receberam transplantes fecais com amostras de doadores humanos saudáveis via gavagem oral. Os ratos dobro do Hu-BLT tiveram perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que foi transplantada. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos dobro do Hu-BLT para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante.
Introduction
Camundongos humanizados (Hu-camundongos) transformaram o estudo de muitos aspectos da saúde humana e da doença, incluindo hematopoiese, imunidade, câncer, doença auto-imune e doenças infecciosas1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estes Hu-ratos têm a vantagem distinta sobre outros modelos do rato que têm um sistema imune humano funcional e podem ser contaminados com os micróbios patogénicos específicos humanos. No entanto, a importância do microbioma intestinal tem sido demonstrada pelo seu papel em muitas doenças humanas, como obesidade, síndrome metabólica, doenças inflamatórias e câncer10,11,12, trezeanos. O sistema imunológico da mucosa e o microbioma intestinal são regulados reciprocamente para manter o intestino e a homeostase sistêmica. O sistema imunológico é moldado por antígenos apresentados pelo microbioma intestinal e reciprocamente o sistema imunológico desempenha um importante papel regulador na promoção de bactérias do intestino comensal e eliminando os patógenos14,15, 16. Entretanto, o microbioma do intestino de Hu-ratos não foi caracterizado bem e o microbioma murino do intestino difere substancialmente na composição e na função dos seres humanos17. Isso se deve às diferenças evolutivas, fisiológicas e anatômicas entre o intestino murino e humano, bem como outros fatores importantes, como a dieta, que podem influenciar os resultados experimentais dos modelos de doença de Hu-camundongos18. Conseqüentemente, além da classificação do microbioma murino do intestino de Hu-ratos, um modelo animal que caracteriza um sistema imunitário humano e um microbioma humano do intestino é necessário estudar as interações complexas da doença humana in vivo.
O estudo de doenças humanas diretamente em indivíduos humanos é muitas vezes impraticável ou antiético. Muitos modelos animais não podem ser usados para estudar patógenos humanos como o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Os modelos de primatas não humanos são geneticamente superados, muito caros e não são suscetíveis a muitos patógenos humanos. Camundongos que foram derivados como germe livre (GF) e reconstituídos com Ademir intestinais semelhantes a humanos têm sido amplamente utilizados para estudar a saúde humana e a doença19,20. No entanto, estes animais não têm um sistema imunológico humano e trabalhar com animais GF requer instalações especializadas, procedimentos e conhecimentos especializados. Portanto, há a necessidade de melhores modelos pré-clínicos para estudar a complexa relação entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico humano. Muitas cepas de camundongos, como NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), não estão disponíveis comercialmente como GF. Os animais GF também podem sofrer de deficiências imunes de longa duração que não são completamente revertidas pelo Engraftment de micróbios21. Conseqüentemente, nós criamos um Hu-ratos dobro que caracterizam um sistema imune humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino circunstâncias específicas do micróbio patogénico livre (SPF). Para gerar ratos Hu-duplos, a cirurgia foi realizada em camundongos NSG para criar ratos de medula óssea, fígado, Timo humanizado (Hu-BLT). Os ratos de Hu-BLT foram tratados então com os antibióticos do espectro largo e deram então transplantações fecais com uma amostra humana saudável do doador. Nós caracterizamos o microbioma bacteriano do intestino de 173 amostras fecais de 45 ratos dobro do Hu-BLT e 4 amostras de doador fecal humanas. Os ratos dobro do Hu-BLT têm os perfis originais do gene de 16S rRNA baseados na amostra fornecedora humana individual que é transplantado. Importante, o microbioma humano-como transplantado era estável nos ratos para a duração do estudo até 14,5 semanas após o transplante. Além, os metagenomas previstos mostraram que os ratos dobro do Hu-BLT têm a capacidade funcional prevista diferente do que Hu-ratos que é mais similar às amostras do doador humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui é para a criação de ratos dobro do Hu-BLT que caracterizam um sistema imunitário humano funcional e um microbioma humano-como estável do intestino. Este protocolo pode ser adaptado a outros modelos de camundongos humanizados ou não humanizados sem a necessidade de animais GF e instalações gnotobióticas. Embora os métodos descritos aqui sejam relativamente simples, existem vários detalhes críticos que são importantes para a criação bem-sucedida de camundongos Double Hu-BLT. Os camu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu por sua ajuda na geração de camundongos humanizados por BLT. Gostaríamos de reconhecer a UNMC Genomics Core Facility que recebe apoio parcial da rede de pesquisa Nebraska em genômica funcional NE-INBRE P20GM103427-14, a biologia molecular dos sistemas Neurosensoriais CoBRE P30GM110768, o Fred & Pamela Centro do cancer de Buffett-P30CA036727, o centro para a inovação da raiz e do Rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e a iniciativa da pesquisa de Nebraska. Gostaríamos de agradecer à Universidade de Nebraska-Lincoln Life Sciences anexo e seus funcionários para a sua assistência. Este estudo é apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) concede R01AI124804, R21AI122377-01, p30 MH062261-16A1 infecção por HIV crônica e envelhecimento em neuroaids (cadeia) centro, 1R01AI111862 para Q li. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, preparação do manuscrito ou decisão de publicação.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
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