Een dubbel gehumaniseerd BLT-muizen model met een stabiele mens-achtige gut Microbiome en menselijk immuunsysteem
Summary
We beschrijven een nieuwe methode voor het genereren van dubbele gehumaniseerde blt-muizen die een functioneel menselijk immuunsysteem en een stabiel geënt mens-achtige gut microbiome bevatten. Dit protocol kan worden gevolgd zonder de noodzaak van kiemvrije muizen of gnotobiotische faciliteiten.
Abstract
Gehumaniseerde muizen (HU-muizen) die beschikken over een functioneel menselijk immuunsysteem hebben fundamenteel veranderd de studie van menselijke pathogenen en ziekte. Ze kunnen worden gebruikt om ziektes te modelleren die anders moeilijk of onmogelijk te bestuderen zijn bij mensen of andere diermodellen. Het microbioom van de darmen kan een diepgaande invloed hebben op de menselijke gezondheid en ziekte. Echter, de Murine gut microbiome is heel anders dan die gevonden bij de mens. Er is behoefte aan verbeterde pre-klinische hu-mice modellen die een geënt menselijke gut microbiome hebben. Daarom hebben we dubbele hu-muizen gemaakt met zowel een menselijk immuunsysteem als een stabiel mensachtig darmmicrobioom. Knik. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) muizen zijn een van de beste dieren voor humanisatie als gevolg van hun hoge niveau van immunodeficiëntie. Echter, kiemvrije NSG-muizen, en diverse andere belangrijke kiemen-vrije muizen modellen zijn momenteel niet commercieel beschikbaar. Verder, veel onderzoekinstellingen hebben geen toegang tot Gnotobiotic faciliteiten, en werken onder Gnotobiotic voorwaarden kunnen vaak duur en tijdrovend. Belangrijk, kiemvrije muizen hebben verschillende Immuundeficiënties die bestaan, zelfs na de engraftment van microben. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld dat geen kiemvrije dieren of gnotobiotische faciliteiten vereist. Voor het genereren van dubbele hu-muizen, NSG muizen werden behandeld met straling voorafgaand aan de operatie te maken beenmerg, lever, Thymus-gehumaniseerd (HU-BLT) muizen. De muizen werden vervolgens behandeld met breedspectrum antibiotica om de reeds bestaande Murine gut microbiome af te putten. Na behandeling met antibiotica kregen de muizen fecale transplantaties met gezonde menselijke donor monsters via een mond sonde. Dubbele hu-BLT muizen hadden unieke 16S rRNA genprofielen gebaseerd op het individuele menselijke donor monster dat werd getransplanteerd. Belangrijk is dat de getransplanteerde mens-achtige microbiome stabiel was in de dubbele hu-BLT muizen voor de duur van de studie tot 14,5 weken na de transplantatie.
Introduction
Gehumaniseerde muizen (HU-muizen) hebben de studie van vele aspecten van de gezondheid van de mens en ziekte, met inbegrip van hematopoiese, immuniteit, Cancer, auto-immuunziekte en besmettelijke ziekte1,2,3,4 getransformeerd ,5,6,7,8,9. Deze hu-muizen hebben het duidelijke voordeel ten opzichte van andere muismodellen, omdat ze een functioneel menselijk immuunsysteem hebben en kunnen worden geïnfecteerd met menselijke specifieke pathogenen. Niettemin is het belang van het microbioom van de darmen aangetoond door zijn rol bij veel menselijke ziekten zoals obesitas, metabool syndroom, ontstekingsziekten en kanker10,11,12, 13. Het mucosale immuunsysteem en gut microbiome zijn samengereguleerd om gut en systemische homeostase te behouden. Het immuunsysteem wordt gevormd door antigenen die worden gepresenteerd door het microbioom van de darmen en het immuunsysteem speelt een belangrijke regelgevende rol bij het bevorderen van commensale gut bacteriën en het elimineren van pathogenen14,15, 16. echter, de gut microbiome van Hu-muizen is niet goed gekarakteriseerd en de Murine gut microbiome verschilt aanzienlijk in samenstelling en functie van mensen17. Dit is te wijten aan evolutionaire, fysiologische en anatomische verschillen tussen de Murine en de menselijke darm, evenals andere belangrijke factoren zoals dieet, die de experimentele resultaten van Hu-mice ziekte modellen kunnen beïnvloeden18. Daarom, naast de classificatie van Murine gut microbiome van Hu-muizen, een diermodel met zowel een menselijk immuunsysteem en menselijke gut microbiome is nodig om te bestuderen van de complexe interacties van menselijke ziekte in vivo.
De studie van menselijke ziekten direct in menselijke proefpersonen is vaak onpraktisch of onethisch. Veel diermodellen kunnen niet worden gebruikt om menselijke pathogenen zoals humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) te bestuderen. Niet-menselijke primaat modellen zijn genetisch gekweekte, erg duur, en zijn niet vatbaar voor veel menselijke pathogenen. Muizen die zijn afgeleid als kiemvrij (GF) en zijn gereconstitueerd met mensachtige gut microbioom zijn op grote schaal gebruikt om de gezondheid van de mens en de ziekte te bestuderen19,20. Deze dieren hebben echter geen menselijk immuunsysteem en het werken met GF-dieren vereist gespecialiseerde faciliteiten, procedures en expertise. Daarom is er behoefte aan verbeterde pre-klinische modellen om de complexe relatie van het microbioom van de darmen en het menselijke immuunsysteem te bestuderen. Vele stammen van muizen, zoals NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), zijn niet commercieel beschikbaar als GF. GF-dieren kunnen ook last hebben van langdurige Immuundeficiënties die niet volledig worden omgekeerd door de engraftment van microben21. Daarom creëerden we een dubbele hu-muizen met zowel een functioneel menselijk immuunsysteem als een stabiel mens-achtig darmmicrobioom onder specifieke pathogenen vrije (SPF) condities. Voor het genereren van dubbele hu-muizen, chirurgie werd uitgevoerd op NSG muizen te maken beenmerg, lever, Thymus gehumaniseerd muizen (HU-BLT). De hu-BLT muizen werden vervolgens behandeld met breedspectrum antibiotica en kregen vervolgens fecale transplantaties met een gezond humaan donor monster. We kenmerkten de bacteriële gut microbiome van 173 fecale monsters van 45 dubbele hu-BLT muizen en 4 menselijke fecale donor monsters. Dubbele hu-BLT muizen hebben unieke 16S rRNA genprofielen gebaseerd op het individuele menselijke donor monster dat wordt getransplanteerd. Belangrijk is dat de getransplanteerde mens-achtige microbiome was stabiel in de muizen voor de duur van de studie tot 14,5 weken na transplantatie. Bovendien toonden de voorspelde metagenomes aan dat dubbele hu-BLT-muizen een verschillende voorspelde functionele capaciteit hebben dan hu-muizen die meer lijken op de menselijke donor monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat hier wordt beschreven, is voor de creatie van dubbele hu-BLT-muizen die zowel een functioneel menselijk immuunsysteem als een stabiel mensachtig darmmicrobioom hebben. Dit protocol kan worden aangepast aan andere gehumaniseerde of niet-gehumaniseerde muizen modellen zonder de noodzaak voor GF-dieren en gnotobiotische faciliteiten. Hoewel de hier beschreven methoden relatief eenvoudig zijn, zijn er verschillende kritieke details die belangrijk zijn voor het succesvol maken van dubbele hu-BLT-muizen. NSG-m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Yanmin WAN, Guobin Kang en Pallabi Kundu bedanken voor hun hulp bij het genereren van BLT-gehumaniseerde muizen. We willen de kern faciliteit van UNMC Genomics erkennen die gedeeltelijke ondersteuning krijgt van het Nebraska Research Network in Functional genomics NE-INBRE P20GM103427-14, de moleculaire biologie van Neurosensorische systemen CoBRE P30GM110768, de Fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, het centrum voor root en Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, en het Nebraska Research Initiative. We willen de Universiteit van Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex en hun medewerkers bedanken voor hun hulp. Deze studie wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 chronische HIV-infectie en veroudering in neuroaids (keten) Center, 1R01AI111862 aan Q Li. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, voorbereiding van het manuscript of besluit voor publicatie.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
