Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale
Summary
Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l’analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.
Abstract
La somministrazione di lipopolioaccharide (LPS) è un modo comune per studiare l’infiammazione polmonare e le lesioni polmonari acute (ALI) in piccoli modelli animali. Sono stati descritti vari approcci, come l’inalazione di LPS aerosolizzato e l’instillazione nasale o intratracheale. Il protocollo presentato descrive una procedura dettagliata passo-passo per indurre ALI nei topi mediante instillazione diretta InTRAtracheal LPS ed eseguire l’analisi FACS di campioni di sangue, liquido bal (Bron) e tessuto polmonare. Dopo la sedazione intraperitoneale, la trachea viene esposta e l’LPS viene somministrato tramite un catetere venoso da 22 G. Una reazione infiammatoria robusta e riproducibile con invasione di leucociti, upregulation delle citochine infiammatorie e interruzione della barriera alveolo-capillare viene indotta in poche ore a giorni, a seconda del dosaggio LPS utilizzato. La raccolta di campioni di sangue, fluido BAL e raccolta polmonare, nonché la lavorazione per l’analisi FACS, sono descritti in dettaglio nel protocollo. Anche se l’uso dell’LPS sterile non è adatto a studiare gli interventi farmacologici nelle malattie infettive, l’approccio descritto offre una minima invasività, una manipolazione semplice e una buona riproducibilità per rispondere a domande immunologiche meccanicistiche. Inoltre, la tezione della dose e l’uso di preparati LPS alternativi o ceppi di topo consentono la modulazione degli effetti clinici, che possono presentare diversi gradi di gravità ALI o in ritardo rispetto all’esordio tardivo dei sintomi della malattia.
Introduction
I modelli animali sperimentali sono indispensabili nella ricerca immunitaria di base. La somministrazione di batteri interi o componenti microbici è stata spesso utilizzata in piccoli modelli animali per indurre l’infiammazione locale o sistemica1. Lipopolysaccharide (LPS, o endotossina batterica) è un componente della parete cellulare e antigene superficiale di batteri gram-negativi (ad esempio, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella sp.). La molecola termostabile e grande (peso molecolare 1-4 x 106 kDa) è costituita da una moiety lipidica (Lipid A), regione centrale (oligosaccharide) e un polisaccharide O (o antigene O). Il lipido A, con le sue catene di acidi grassi idrofobici, ancora la molecola in una membrana batterica e media (sulla degradazione dei batteri) l’attività immunologica e la tossicità degli LPS. Dopo il legame con la proteina legante LPS (LBP), i complessi LPS:LBP si legano il complesso del recettore CD14/TLR4/MD2 situato sulla superficie di molti tipi di cellule, inducendo una forte reazione infiammatoria con traslocazione nucleare NF-B e successiva upregulation dell’espressione citochina2.
Lesione polmonare acuta (ALI) è definita come insufficienza respiratoria iposemica acuta con edema polmonare bilaterale in assenza di insufficienza cardiaca3. La somministrazione di LPS è un modo comune per indurre infiammazione polmonare e ALI4,5,6,7. Anche se la sostanza sterile non è adatta a studiare gli interventi farmacologici nelle malattie infettive, le domande immunologiche meccanicistiche possono essere risolte con adeguata precisione. L’instillazione di LPS nella trachea induce una reazione infiammatoria robusta con invasione di leucociti, upregulation delle citochine infiammatorie e interruzione della barriera alveolo-capillare entro poche ore o giorni, a seconda del dosaggio di LPS3, 6,7.
Il protocollo presentato descrive una procedura dettagliata passo-passo per indurre ALI nei topi per instillazione Intratracheale LPS. Il modello è stato convalidato valutando l’espressione della citochina, l’invasione dei granulociti dei neutrofili e la perdita di albumina intra-alveolare come descritto in precedenza8.
Protocol
Representative Results
Discussion
La minima invasività, la manipolazione semplice e la buona riproducibilità sono caratteristiche chiave dell’approccio presentato per indurre ALI in un piccolo modello di roditore. L’uso di LPS invece di batteri interi nei modelli animali ha dei vantaggi. È un composto stabile e puro e può essere conservato in forma liofilizzata fino all’uso. È un potente stimolante per le risposte immunitarie innate attraverso il percorso TLR4, e la sua attività biologica può essere facilmente quantificata, facilitando la titolazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jan Kleiner e Susanne Schulz per aver fornito supporto tecnico. Gli autori riconoscono l’eccellente supporto della struttura centrale di citometria di flusso presso la facoltà di medicina dell’Università di Bonn. Gli autori non hanno ricevuto alcun finanziamento da alcuna organizzazione esterna. Parte dei dati forniti nella sezione dei risultati e illustrati nella figura 3 è già stata mostrata in una precedente pubblicazione8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
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