Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Summary

É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.

Abstract

A administração das vias aéreas de lipopolissacárido (LPS) é uma maneira comum de estudar a inflamação pulmonar e a lesão pulmonar aguda (ALI) em modelos animais pequenos. Várias aproximações foram descritas, tais como a inalação de LPs aerosolized assim como a instilação nasal ou intratraqueal. O protocolo apresentado descreve um procedimento passo a passo detalhado para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal direta dos LPs e executa a análise de FACS das amostras de sangue, do líquido broncoalveolar do lavagem (BAL), e do tecido do pulmão. Após sedação intraperitoneal, a traquéia é exposta e a LPS é administrada através de cateter venoso de 22 G. Uma reação inflamatória robusta e reprodutível com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias, e ruptura da barreira alveolo-capilar é induzida dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS usada. A coleta de amostras de sangue, o fluido de LBA e a colheita pulmonar, bem como o processamento para a análise de FACS, são descritos detalhadamente no protocolo. Embora o uso do LPS estéril não seja adequado para estudar intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, a abordagem descrita oferece uma invasividade mínima, manuseio simples e boa reprodutibilidade para responder a questões imunológicas mecanísticas. Além disso, a titulação da dose assim como o uso de preparações alternativas do LPS ou de tensões do rato permitem a modulação dos efeitos clínicos, que podem apresentar graus diferentes de severidade de ALI ou início contra o início atrasado de sintomas da doença.

Introduction

Modelos experimentais de animais são indispensáveis na pesquisa imunológica básica. A administração de bactérias inteiras ou componentes microbianos tem sido freqüentemente usada em pequenos modelos animais para induzir inflamação local ou sistêmica¹. Lipopolissacarídeo (LPS, ou endotoxina bacteriana) é um componente da parede celular e antígeno de superfície de bactérias Gram-negativas (por exemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., ou Legionella spp.). A molécula termotérmica e grande (peso molecular 1-4 x 10⁶ kDa) consiste em uma fração lipídica (lipídios a), região central (oligossacarídeos), e um polissacarídeos o (ou o antígeno). O lipídio a, com suas correntes de ácidos graxos hidrofóbicos, Ancora a molécula em uma membrana bacteriana e Medeia (após a degradação das bactérias) a atividade imunológica e a toxicidade dos LPs. Após ligação à proteína de ligação LPS (LBP), os complexos LPS: LBP ligam o complexo receptor CD14/TLR4/MD2 localizado na superfície de muitos tipos de células, induzindo uma forte reação pró-inflamatória com translocação nuclear de NF-κB e subsequente upregulação da expressão de citocina².

A lesão pulmonar aguda (ALI) é definida como insuficiência respiratória hipoxêmica aguda com edema pulmonar bilateral na ausência de insuficiência cardíaca³. A administração das vias aéreas de LPs é uma forma comum de induzir inflamação pulmonar e ali^4,5,6,7. Embora a substância estéril não seja adequada para o estudo de intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, as questões imunológicas mecanísticas podem ser respondidas com precisão adequada. A instilação de LPS na traquéia induz uma reação inflamatória robusta com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias e ruptura da barreira alveolócapilar dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS^{3, 6,7}.

O protocolo apresentado descreve um procedimento detalhado da etapa-por-etapa para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal dos LPs. O modelo foi validado avaliando-se a expressão de citocinas, invasão de granulócitos neutrofínicos e vazamento de albumina intralalveolar, conforme descrito anteriormente⁸.

Protocol

Este protocolo animal foi aprovado pelo comitê local para o cuidado animal (LANUV, Recklinghausen, Germany; protocolo no. 84-02.04.2015) e foi executado de acordo com as directrizes nacionais dos institutos de saúde para o uso de animais vivos (publicação de NIH N º 85-23, revisado em 1996). 1. indução de ALI Use adultos C57BL/6 camundongos em idades de cerca de 10-12 semanas. Abrigar os animais em gaiolas individualmente ventiladas com acesso gratuito à água e ração de ro…

Representative Results

A aproximação descrita para induzir o ali nos ratos foi validada avaliando a expressão do citocinas, a infiltração do granululocyte do neutrófilo, e o rompimento alveolo-capilar da barreira 24 h e 72 h após a instilação dos LPs. Os animais injetados em PBS serviram de controle. A administração de LPS intratraqueal induziu uma resposta pró-inflamatória pulmonar robusta. A expressão de TNF-α no tecido pulmonar foi significativamente upregulada, atingindo um aumento sustentado e maior que 50 vezes comparado a…

Discussion

A invasividade mínima, a manipulação simples e a boa reprodutibilidade são características-chave da abordagem apresentada para induzir a ALI em um pequeno modelo de roedores. O uso de LPS em vez de bactérias inteiras em modelos animais tem vantagens. É um composto estável e puro e pode ser armazenado em forma liofilizada até o uso. É um potente estimulante para respostas imunes inatas através da via TLR4, e sua atividade biológica pode ser prontamente quantificada, facilitando a titulação da severidade da d…

Materials

1 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300013
10 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	309110
Anti-CD115 (c-fms) APC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) – FITC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) – eF450	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7	Bio Legend, San Diego, CA	127623
Buprenorphine hydrochloride	Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old	Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	340487
Canula 23 gauge 1''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300800
Canula 26 gauge 1/2''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	303800
Cell strainer 70 µm	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	352350
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	1148089
Deoxyribonuclease II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8764
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E7889
FACS tubes, 5 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	551579
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F2442
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11049-10
Isoflurane	Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	553141
Red blood cell lysis buffer	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	14060-09
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S2002
Spring scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15018-10
Tissue forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11021-12
Tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	30125150
Venous catheter, 22 gauge	B.Braun, Melsungen, Germany	4268091B
Xylazine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany