직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는
Summary
여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.
Abstract
리포폴리사카라이드(LPS)의 기도 투여는 작은 동물 모델에서 폐 염증 및 급성 폐 손상(ALI)을 연구하는 일반적인 방법이다. 에어로졸화된 LPS의 흡입뿐만 아니라 비강 또는 내외 주입과 같은 다양한 접근법이 기술되었다. 제시된 프로토콜은 직접적인 경질 LPS 주입에 의해 마우스에서 ALI를 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥세척기(BAL) 유체 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하는 상세한 단계별 절차를 기술한다. 복강 내 침전 후, 기관노출 및 LPS는 22 G 정맥 카테터를 통해 투여된다. 백혈구 침략을 가진 강력하고 재현 가능한 선동적인 반응, 전염증성 사이토카인의 upregulation, 및 alveolo-모세관 방벽의 중단은 사용된 LPS 복용량에 따라서, 일 에서 일 안에 유도됩니다. FACS 분석을 위한 처리뿐만 아니라 혈액 샘플, BAL 유체 및 폐 수확의 수집은 프로토콜에 상세히 기술되어 있다. 멸균 LPS의 사용은 전염병에 있는 약리학적 내정간섭을 공부하기 위하여 적당하지 않더라도, 기술된 접근은 기계론적 면역학 질문에 대답하기 위하여 최소한의 침략, 간단한 취급 및 좋은 재현성을 제안합니다. 더욱이, 용량 적정뿐만 아니라 대체 LPS 제제 또는 마우스 균주의 사용은 임상 적효과의 변조를 허용하며, 이는 다른 정도의 ALI 심각도 또는 질병 증상의 조기 발병을 나타낼 수 있다.
Introduction
실험동물 모델은 기본적인 면역 연구에서 없어서는 안 될 존재입니다. 전체 박테리아 또는 미생물 성분의 투여는 국소 또는 전신 염증을유도하기 위해 작은 동물 모델에서 자주 사용되어 왔다 1. 리포폴리사카라이드(LPS, 또는 세균 내독소)는 그람 음성 박테리아의 세포벽 성분 및 표면 항원(예를 들어, 장내세균, 슈도모나스 종, 또는 레지오넬라 종)이다. 열안정 및 대형 분자(분자량 1-4 x 106 kDa)는 지질 모에티(Lipid A), 코어 영역(올리고사카라이드) 및 O 다당류(또는 O 항원)로 구성된다. 지질 A는 소수성 지방산 사슬을 가진 분자를 세균 막에 고정시키고 LPS의 면역 학적 활성 과 독성을 (박테리아의 분해 시)합니다. LPS 결합 단백질 (LBP)에 결합 한 다음, LPS : LBP 복합체는 많은 세포 유형의 표면에위치한 CD14 / TLR4 / MD2 수용체 복합체를 리게이트하여 NF-θB 핵 전좌 및 후속 업 조절을 통해 강력한 전염증반응을 유도합니다. 사이토 카인 발현2.
급성 폐 손상(ALI)은 심부전이 없는 양측 폐 부종과 함께 급성저산소성 호흡부전으로 정의된다 3. LPS의 기도 투여는 폐 염증 및 ALI 4, 5,6,7을유도하는 일반적인 방법이다. 멸균 물질은 전염병에 있는 약리학적인 내정간섭을 공부하기 위하여 적당하지 않더라도, 기계론적 면역학 질문은 적당한 정밀도로 대답될 수 있습니다. 기관에 LPS를 주입하면 백혈구 침입, 전염증성 사이토카인의 업조절, LPS 투여량에 따라 몇 시간에서 며칠 내에 알베올로 모세혈관 장벽의 중단을 가진 강력한 염증 반응을 유도합니다3. 6,7.
제시된 프로토콜은 경내 LPS 주입에 의해 마우스에서 ALI를 유도하는 상세한 단계별 절차를 기술한다. 이 모델은 앞서 설명한바와같이 사이토카인 발현, 호중구 과립구 침입 및 폐포 내 알부민 누설을 평가함으로써 검증되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최소한의 침습성, 간단한 취급 및 좋은 재현성은 작은 설치류 모델에서 ALI를 유도하는 제시된 접근법의 주요 특징이다. 동물 모델에서 전체 박테리아 대신 LPS를 사용하는 것은 장점이 있습니다. 그것은 안정적이 고 순수한 화합물 이며 사용 될 때까지 동약 형태로 저장할 수 있습니다. 그것은 TLR4 통로를 통해 타고난 면역 반응을 위한 강력한 자극제이고, 그것의 생물학 활동은 좋은 재현성으로 질…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 얀 클라이너와 수잔 슐츠가 기술 지원을 제공한 것에 대해 감사를 표하고자 합니다. 저자는 본 대학의 의학 학부에서 유동 세포 측정 핵심 시설의 우수한 지원을 인정. 저자는 외부 조직으로부터 자금을 받지 못했습니다. 그림 3에 설명된 결과 섹션에 제공된 데이터의 일부는 이미 이전 발행물8에나와 있습니다.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
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