Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

Published: September 12, 2019

doi:

Francesco Simone Ruggeri, Tomas Šneideris², Sean Chia, Michele Vendruscolo, Tuomas P. J. Knowles³

¹Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, ²Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, ³Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

Descriviamo l’applicazione della nanospettroscopia a infrarossi e della microscopia a forza atomica ad alta risoluzione per visualizzare il processo di autoassemblaggio delle proteine in aggregati oligomerici e fibrille amiloidi, che è strettamente associato all’insorgenza e allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi umani.

Abstract

Il fenomeno del ripiegamento e dell’aggregazione delle proteine porta alla formazione di aggregati proteici altamente eterogenei, associati a condizioni neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. In particolare gli aggregati a basso peso molecolare, gli oligomeri amiloidi, hanno dimostrato di possedere proprietà citotossiche generiche e sono implicati come neurotossine in molte forme di demenza. Illustriamo l’uso di metodi basati sulla microscopia a forza atomica (AFM) per affrontare il difficile compito di caratterizzare le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche di questi aggregati, che sono difficili da studiare utilizzando le strutturali convenzionali metodi biofisici sfusi a causa della loro eterogeneità e natura transitoria. Gli approcci di microscopia a sonda a scansione sono ora in grado di studiare la morfologia degli aggregati amiloidi con risoluzione sub-nanometrica. Dimostriamo qui che la nanospettroscopia a infrarossi (AFM-IR), che sfrutta contemporaneamente l’alta risoluzione dell’AFM e il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, può andare oltre e consentire la caratterizzazione delle proprietà strutturali dei singoli aggregati proteici, e quindi offrono approfondimenti sui meccanismi di aggregazione. Poiché l’approccio che descriviamo può essere applicato anche alle indagini sulle interazioni delle assemblee proteiche con piccole molecole e anticorpi, può fornire informazioni fondamentali per sviluppare nuovi composti terapeutici per diagnosticare o trattare disturbi neurodegenerativi.

Introduction

Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)¹ e le malattie di Parkinson (PD)^2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide³^, ^4.Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione di amiloidi, tuttavia, rimangono poco chiare, in gran parte a causa dell’alto livello di eterogeneità, natura transitoria e su scala nanometrica dimensioni degli aggregati patologici⁴^,⁵.

Indagini di grande successo sulle strutture proteiche negli ultimi decenni si sono basate ampiamente sull’uso di metodi sfusi, tra cui la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare⁵^, 6 È ^possibile: ^, ^{7 (in} questo stato ^, 8 (IN ^vio ^, ⁹. All’interno di questa classe di tecniche, la spettroscopia a infrarossi (IR) è emersa come uno strumento analitico sensibile per svelare le proprietà chimiche dei sistemi biologici come le proteine⁸. I metodi di iR consentono la quantificazione delle variazioni strutturali secondarie e quaternarie durante il loro misfolding e aggregazione. Inoltre, al fine di decifrare ulteriormente a livello microscopico i dettagli meccanicistici coinvolti nei complessi paesaggi di energia libera delle proteine durante la loro aggregazione, un importante progresso è stato lo sviluppo di strumenti di cinetica chimica per estendere a complessi percorsi di auto-assemblaggio tra cui amiloide fibrille formazione⁵^,⁶^,⁷^,¹⁰^,¹¹^,¹². Tuttavia, i metodi spettroscopici di massa forniscono solo informazioni medie sull’insieme eterogeneo di specie presenti nella soluzione o coinvolte in specifici passaggi microscopici, rendendo così lo studio delle proprietà biofisiche dei singoli specie aggregate impegnative al livello su nanoscala¹³^,¹⁴.

Diverse tecniche di microscopia con la capacità di operare su scale più piccole del limite di diffrazione della luce sono emerse negli ultimi decenni. Questa classe di metodi include la microscopia elettronica (EM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) forniscono immagini bidimensionali (2D) di un campione, l’AFM è emersa negli ultimi decenni come una tecnica potente e versatile per studiare morfologie tridimensionali (3D), come così come le proprietà nanomeccaniche di un campione con risoluzione sub-nanometrica¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^, ^{20 anni} ^, ^{21 Mieto} ^, ^{22 Milia} ^, ²³ del 23 o ^, ²⁴ Mi lasa’ di ^, ^{25 mi lato} ^, ²⁶ del sistema di ^, ^27.La logica alla base dello studio dell’aggregazione proteica tramite AFM è che questo approccio consente di studiare la morfologia delle singole specie presenti nella soluzione¹³^,¹⁴^,¹⁶^, ¹⁷^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²⁵^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^, ³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷. In particolare, monitorando il campione in funzione del tempo, AFM consente di sforare l’evoluzione della morfologia della specie all’interno del campione, che permette di seguire e visualizzare i percorsi di formazione di amiloidi²³^, ²⁵^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Inoltre, AFM consente la quantificazione dei parametri strutturali come le altezze e le lunghezze trasversali delle singole specie presenti nella soluzione¹³^,¹⁹^,³⁰^,³¹ ^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,⁴⁰^,⁴³^, ^{44 (di sistema)} ^, ^{45 anni} ^, ⁴⁶ per quanto ^, ^{47 o} ^, ⁴⁸. Tuttavia, lo studio di una singola proprietà biofisica, come la morfologia, spesso non è sufficiente quando si studiano sistemi biologici eterogenei e complessi. I metodi di imaging AFM, SEM o TEM da soli non rivelano facilmente le proprietà chimiche delle specie eterogenee di aggregati amiloidi su scala nanometrica.

Un importante progresso per l’analisi di campioni biologici eterogenei di questa portata è stato recentemente fatto con lo sviluppo e l’applicazione al campo dell’aggregazione proteica della nanospettroscopia infrarossa (AFM-IR)²⁴^,²⁶^, ³⁸^,⁴²^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵². Questo metodo innovativo sfrutta la combinazione della risoluzione spaziale dell’AFM (1-10 nm) con il potere di analisi chimica di IR. La tecnica AFM-IR si basa sulla misurazione dell’effetto di risonanza indotta fototermica guidato da un laser AIR e sulla misurazione dell’espansione termica del campione in esame da parte della punta AFM. Il campione può essere illuminato dal laser a infrarossi direttamente dall’alto o dal basso nella riflessione interna totale, come nella spettroscopia a infrarossi convenzionale²⁴^,⁴²^,⁵²^,⁵³. Il laser a raggi IR può essere pulsato con frequenze tipiche nell’ordine di centinaia di kilohertz (1,1000 kHz) e sintonizzato su un’ampia gamma spettrale, in genere tra i 1000-3300 cm^-1. Anche se la sorgente laser copre un’area di 30 m di diametro, la risoluzione spaziale della tecnica AFM-IR è determinata nominalmente dal diametro della punta AFM, che rileva l’espansione termica locale del sistema. AFM-IR è adatto per studiare campioni biologici perché il segnale IR è proporzionale al loro spessore fino a 1,5 m, e gli spettri IR risultanti sono generalmente in accordo con i corrispondenti spettri di trasmissione FTIR¹³^,⁵⁴ ^,⁵⁵. Per questo motivo, i metodi stabiliti di analisi in spettroscopia possono essere facilmente applicati, come lo studio dei cambiamenti chimici, il cambiamento della forma della banda e la de-convoluzione mediante l’analisi dei secondi derivati⁵². Nel complesso, combinando la risoluzione spaziale dell’AFM con il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, AFM-IR consente l’acquisizione simultanea di un’ampia gamma di proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche di un campione su scala nanometrica.

Qui, illustriamo un protocollo per la caratterizzazione del processo di aggregazione proteica che sfrutta la combinazione di saggi di fluorescenza in vitro, imaging AFM ad alta risoluzione e AFM-IR su nanometrica. Questo approccio combinato ha già eccellere nel fornire risultati dettagliati nello studio delle proprietà chimiche e strutturali delle singole micro-goccioline formate da aggregati proteici, nello studio della separazione di fase delle proteine liquide liquide e in studiare l’eterogeneità e le proprietà biofisiche delle singole specie aggregate su nanoscala²³^,²⁶^,³⁸^,⁴⁵^,⁵⁰^,⁵³^, ⁵⁶^,⁵⁷.

Protocol

1. Saggi di aggregazione sui lettori di placche a fluorescenza NOTA: Il protocollo qui descritto è un esempio di come studiare l’aggregazione di qualsiasi proteina o peptide da cinetica chimica. In particolare, descrive un protocollo ottimizzato per studiare l’aggregazione del peptide A42, che è coinvolto nell’insorgenza e nella progressione del morbo di Alzheimer58,59. Un protocollo simile può essere regolato e adottato per studiare …

Representative Results

Nella figura 1 è illustrato un corso di tempo rappresentativo di aggregazione a 42, misurato dal saggio di fluorescenza ThT, nella Figura 1. Il processo di aggregazione è comunemente caratterizzato da una curva sigmoidale, in cui si osserva inizialmente una fase di ritardo, ed è seguito da una fase di crescita ripida, prima che la curva raggiunga un altopiano quando viene raggiunto uno stato stabile di equilibrio6,7 , <…

Discussion

Il primo passo critico di questo protocollo è la preparazione di proteine monomeriche, come nel caso della soluzione A42 descritta nei passaggi 1.1 e 1.2. È essenziale avviare il processo di aggregazione da una soluzione monomerica altamente pura, in quanto la presenza di specie oligomeriche o aggregate può provocare una scarsa riproducibilità della cinetica di aggregazione⁵⁸e indurre artefatti nell’AFM misurazioni (ad esempio, le specie di fibrillar saranno evidenti nelle fasi iniziali dell’a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNF) per il sostegno finanziario (numero di sovvenzione P2ELP2_162116 e P300P2_171219), il programma Darwin College, Erasmus la ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell’ambito del settimo programma quadro dell’Unione europea (FP7/2007-2013) attraverso la sovvenzione del CER PhysProt (numero di accordo 337969), la Newman Foundation (T.P.J.K.) e la Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. e T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001

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