Summary

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Published: September 12, 2019
doi:

Summary

Nós descrevemos a aplicação da nanoespectroscopia infravermelha e da microscopia de alta resolução da força atômica para visualizar o processo do self-assembly da proteína em agregados oligoméricas e em fibrilas do amilóide, que é associada pròxima com o início e o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos humanos.

Abstract

O fenômeno de desdobramento de proteínas e agregação resulta na formação de agregados proteicos altamente heterogêneos, que estão associados a condições neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. Em particular os agregados de baixo peso molecular, oligomers do amilóide, foram mostrados para possuir Propriedades citotóxica genéricas e são implicados como neurotoxinas em muitas formas de demência. Nós ilustramos o uso de métodos baseados na microscopia de força atômica (AFM) para abordar a tarefa desafiadora de caracterizar as propriedades morfológicas, estruturais e químicas desses agregados, que são difíceis de estudar usando estruturas estruturais convencionais métodos ou métodos biofísicos em massa devido à sua heterogeneidade e natureza transitória. Abordagens de microscopia de sonda de varredura agora são capazes de investigar a morfologia de agregados amilóides com resolução de subnanômetro. Mostramos aqui que a nanoespectroscopia de infravermelho (IR) (AFM-IR), que explora simultaneamente a alta resolução do AFM e o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, pode ir mais longe e possibilitar a caracterização das propriedades estruturais de indivíduos agregados proteicos e, assim, oferecem insights sobre os mecanismos de agregação. Desde que a aproximação que nós descrevemos pode ser aplicada também às investigações das interações de conjuntos da proteína com moléculas e anticorpos pequenos, pode entregar a informação fundamental para desenvolver compostos terapêuticos novos para diagnosticar ou tratar distúrbios neurodegenerativos.

Introduction

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)1 e Parkinson (PD)2 doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides3, 4. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos4,5.

Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas8. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides5,6,7,10,11,12. No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala13,14.

Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro13,14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides23, 25,38,39,40,41,42. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.

Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR13,54 ,55. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos52. Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.

Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. ensaios de agregação em leitores de placas de fluorescência Nota: o protocolo aqui descrito é um exemplo de como estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo por cinética química. Em particular, descreve um protocolo otimizado para estudar a agregação do peptídeo aβ 42, que está envolvido no início e progressão da doença de Alzheimer58,59. Um protocolo semelhante pode ser ajustado e adotado para estudar a agr…

Representative Results

Um curso de tempo representativo da agregação aβ 42, medido pelo ensaio de fluorescência ThT, é mostrado na Figura 1. O processo de agregação é comumente caracterizado por uma curva sigmoidal, onde uma fase de retardo é inicialmente observada, e é seguida por uma fase de crescimento íngreme, antes que a curva atinja um planalto quando um estado estacionário de equilíbrio é atingido6,7 , 58</…

Discussion

O primeiro passo crítico neste protocolo é a preparação de proteínas monoméricas, como no caso da solução aβ 42 descrita nas etapas 1,1 e 1,2. É essencial iniciar o processo de agregação a partir de uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies oligoméricas ou agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética de agregação58e induzir artefatos no AFM medidas (por exemplo, as espécies fibrilares serão evidentes nas fases iniciais da agregaçã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Swiss National Foundation for Science (SNF) pelo apoio financeiro (Grant Number P2ELP2_162116 e P300P2_171219), o Darwin College, programa Erasmus + para o apoio financeiro (Grant Number 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) e o investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (7. º PQ/2007-2013) através da subvenção do CEI PhysProt (acordo n. º 337969), da Fundação Newman (T.P.J.K.) e da Centro de Cambridge para doenças misfolding (CG, T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie – International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V., Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. , 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie – International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie – International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C., Braga, P. C., Ricci, D. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. 736, 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B., Frewin, C. L. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology – From Cell to Protein. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. . Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

View Video