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生物化学

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/60108
, , , ,
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

우리는 개시 및 발달과 밀접하게 연관되는 올리고머 응집체 및 아밀로이드 섬유로 단백질 자기 조립의 과정을 구상하기 위하여 적외선 나노 스펙트로스카 및 고해상도 원자력 현미경 검사법의 응용을 기술합니다 인간의 신경 퇴행성 질환의 넓은 범위의.

Abstract

단백질 오접기 및 응집 현상은 알츠하이머병및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 조건과 관련된 고이질성 단백질 응집체의 형성을 초래합니다. 특히 낮은 분자량 응집체, 아밀로이드 올리고머는 일반적인 세포 독성 특성을 가지고 있는 것으로 나타났으며 많은 형태의 치매에서 신경 독소로 연루되어 있습니다. 우리는 기존의 구조적 을 사용하여 연구하기 어려운 이러한 응집체의 형태학적, 구조적 및 화학적 특성을 특성화하는 어려운 과제를 해결하기 위해 원자력 현미경 검사법 (AFM)을 기반으로하는 방법의 사용을 설명합니다. 이질성과 일시적인 성질 때문에 방법 또는 대량 생물 물리학적 방법. 스캐닝 프로브 현미경 접근법은 이제 나노미터 이하의 분해능으로 아밀로이드 응집체의 형태를 조사할 수 있습니다. 우리는 동시에 AFM의 높은 해상도와 IR 분광법의 화학 인식 능력을 악용 적외선 (IR) 나노 스펙트로스법 (AFM-IR)이 더 나아가 개인의 구조적 특성의 특성화를 가능하게 할 수 있음을 보여줍니다 따라서 응집 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리가 설명하는 접근은 작은 분자 및 항체를 가진 단백질 집합의 상호 작용의 조사에또한 적용될 수 있기 때문에, 진단하거나 취급하기 위하여 새로운 치료 화합물을 개발하기 위하여 근본적인 정보를 제공할 수 있습니다 신경 퇴행성 질환.

Introduction

전 세계적으로 4천만 명 이상이 현재 알츠하이머(AD)1및 파킨슨병(PD)2질환과 같은 신경퇴행성 질환의 영향을 받고 있습니다. 더 일반적으로, 50개 이상의 병리학은 단백질 오측 및 응집과 분자 수준에서 연관되며, 아밀로이드 침전물로 알려진 불용성 섬유소 단백질 응집체의 증식을 유도하는과정3, 4. 신경 변성의 분자 기원과 아밀로이드 형성으로 이어지는 단백질의 단백질 형태 변화와의 연관성은 이질성, 일시적 성질 및 나노 스케일의 높은 수준 때문에 많은 부분에서 불분명하게 남아 있습니다. 병리학 적 응집체 의 크기4,5.

지난 수십 년 동안 단백질 구조에 대한 매우 성공적인 조사는 X 선 결정학, 극저온 전자 현미경 및 핵 자기 공명 분광법을 포함한 벌크 방법의 사용에 널리 기반을 두고 있습니다5, 6개 , 7명 , 8개 , 9. 이러한 종류의 기술 내에서 적외선 (IR) 분광법은 단백질8과같은 생물학적 시스템의 화학적 특성을 해명하는 민감한 분석 도구로 부상했습니다. IR 방법은 잘못 접고 응집하는 동안 단백질 이차 및 사분의 구조적 변화의 정량화를 허용합니다. 또한, 미세한 수준에서 더 해독하기 위해 그들의 응집 동안 단백질의 복잡한 자유 에너지 풍경에 관여하는 기계적 세부 사항은, 복잡한 으로 확장하는 화학 역학 도구의 개발이 주요 진전되었습니다. 아밀로이드 섬유형성5,6,7,10,11,12를포함한 자가 조립 경로. 그러나 대량 분광 방법은 용액에 존재하거나 특정 현미경 단계에 관여하는 종의 이기종 앙상블에 대한 평균 정보만 제공하므로 개인의 생물 물리학적 특성에 대한 조사가 가능합니다. 나노 규모 수준에서 도전 집계 종13,14.

빛의 회절 한계보다 작은 저울에서 작동 할 수있는 능력을 가진 여러 현미경 기술이 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 방법의 이 부류는 전자 현미경 검사법 (EM) 및 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 포함합니다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)은 표본의 2 차원 (2D) 심상을 제공하는 동안, AFM은 3 차원 (3D) 형태를 연구하는 강력하고 다양한 기술로 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 뿐만 아니라 하위 나노 미터 해상도13,14,15,16,17,18,19와샘플의 나노 기계적특성으로, 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27. AFM을 통한 단백질 응집을 연구하는 근거는 이 접근법이 용액13,14,16에존재하는 개별 종의 형태를 조사할 수 있다는 것입니다. 17,19,20,21,25 ,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. 특히, 시료를 시간의 함수로 모니터링함으로써, AFM은 시료 내 종의 형태학적 진화에 대한 조사를 가능하게 하며, 이는 아밀로이드형성(23)의경로를 따르고 시각화할 수 있게한다. 25,38,39,40,41,42. 또한 AFM은 용액13,19,30,31에 존재하는 개별 종의 단면 높이 및 길이와 같은 구조적 파라미터의 정량화를 가능하게 합니다. ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44세 , 45세 , 46세 , 47세 , 48. 그러나 형태학과 같은 단일 생물 물리학적 특성에 대한 연구는 종종 이기종적이고 복잡한 생물학적 체계를 연구할 때 충분하지 않다. AFM, SEM 또는 TEM 이미징 방법만으로는 나노 스케일에서 아밀로이드 응집체의 이질적인 종의 화학적 특성을 쉽게 드러내지 않습니다.

이 규모의 이질성 생물학적 시료의 분석을 위한 주요 진전은 최근 적외선 나노스펙트로스프로그(AFM-IR)24,26, 24, 26의단백질 응집 분야에 대한 개발 및 적용으로 이루어졌습니다. 38,42,49,50,51,52. 이 혁신적인 방법은 AFM(~1−10 nm)의 공간 분해능과 IR의 화학적 분석 능력을 결합합니다. AFM-IR 기술은 IR 레이저에 의해 구동되는 광열 유도 공진 효과의 측정및 AFM 팁에 의한 조사 중인 시료의 열 팽창 측정을 기반으로 합니다. 샘플은 기존의 적외선 분광법24,42,52,53과 마찬가지로 총 내부 반사에서 상부 또는 아래에서 직접 IR 레이저에 의해 조명 될 수 있습니다. . IR 레이저는 수백 킬로헤르츠(1-1000 kHz)의 순서로 일반적인 주파수로 펄스할 수 있으며 일반적으로 1000-3300cm-1사이의 넓은 스펙트럼 범위에서 튜닝될 수 있습니다. 레이저 소스가 ~ 30 μm 직경의 영역을 커버하지만, AFM-IR 기술의 공간 해상도는 시스템의 국부적 열 팽창을 감지하는 AFM 팁 직경에 의해 명목상으로 결정됩니다. AFM-IR은 IR 신호가 최대 1-1.5 μm의 두께에 비례하기 때문에 생물학적 샘플을 연구하는 데 적합하며, 생성된 IR 스펙트럼은 일반적으로 해당 FTIR 전송 스펙트럼13,54와 일치합니다. ,55. 이러한 이유로, 분광학에서 확립된 분석 방법은 제2 유도체분석에의한 화학적 변화, 대역 형상 변화 및 탈컨볼에 대한 연구와 같은 용이하게 적용될 수 있다. 전반적으로 AFM의 공간 분해능과 IR 분광법의 화학적 인식 력을 결합한 AFM-IR은 나노 스케일에서 시료의 다양한 형태학적, 기계적 및 화학적 특성을 동시에 수집할 수 있게 합니다.

여기서, 우리는 시험관 내 형광 분석법, 고해상도 AFM 이미징 및 나노 스케일 AFM-IR의 조합을 이용하는 단백질 응집 과정의 특성화를 위한 프로토콜을 설명한다. 이 결합된 접근법은 이미 단백질 응집체에 의해 형성된 개별 미세 방울의 화학적 및 구조적 특성을 연구하고, 액체-액체 단백질 상 분리에 대한 연구에서 상세한 결과를 제공하는 데 탁월했습니다. 나노 규모23,26,38,45,50,53에서개별 집계 종의 이질성 및 생물 물리학적 특성을 조사 56,57.

Protocol

1. 형광 판 판독기에 대한 집계 어설션 참고: 여기에 설명된 프로토콜은 화학 역학에 의한 임의의 단백질 또는 펩티드의 응집을 연구하는 방법의 예이다. 특히, 알츠하이머병58,59의발병 및 진행에 관여하는 Aβ42 펩티드의 응집을 연구하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명한다. 유사한 프로토콜은 임의의 단백질 또는 펩티드의 응집을 ?…

Representative Results

ThT 형광 분석에 의해 측정된 Aβ42 응집의 대표적인 시간 과정은 도 1에도시되어 있다. 응집 과정은 일반적으로 시그모이드 곡선을 특징으로하며, 여기서 지연 단계가 처음에 관찰되고, 곡선이 평형 정상 상태에 도달하면 고원에 도달하기 전에 가파른 성장 단계가 뒤따릅니다6,7 , 58. 집계 프로세스<sup class=…

Discussion

이 프로토콜의 제1 중요한 단계는 단계 1.1 및 1.2에 기재된 Aβ42 용액의 경우와 같은 단일성 단백질의 제조이다. 고도로 순수한 단일성 용액에서 응집 과정을 시작하는 것이 필수적입니다, 올리고머 또는 응집 종의 존재는 응집 역학의 가난한 재현성 귀착될 수 있기 때문에58,및 AFM에 있는 유물을 유도하기 위하여 측정 (예를 들어, 섬유종은 집계의 초기 단계에서 분명할 것이며, 이…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 재정 지원 (보조금 번호 P2ELP2_162116 및 P300P2_171219), 금융 지원을위한 다윈 대학, 에라스무스 + 프로그램 (보조금 번호 2018-1-LT01-KA103-KA103-046719-15400-P3)에 대한 스위스 국립 과학 재단 (SNF)에 감사드립니다 이러한 결과로 이어지는 연구는 ERC 보조금 PhysProt (계약 번호 337969), 뉴먼 재단 (T.P.J.K.) 및 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013)에 따라 유럽 연구위원회로부터 자금을 받았다 잘못 접는 질병을 위한 캠브리지 센터 (C.G., M.V., 및 T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).
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