מערכת מיקרופיזיולוגית מעיים/כבד להערכת תרופות פרמקוקנטיות וטוקסיקולוגיות
Summary
חשפנו מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS) עם אורגנואידים במעי וכבד פרצטמול (APAP). מאמר זה מתאר את השיטות לייצור אורגנואידים והערכות רכוש פרמקוקינטי וטוקסיקולוגי APAP ב MPS. הוא גם מתאר את ניתוחי פונקציונליות הרקמה הדרושים כדי לאמת את התוצאות.
Abstract
מערכות מיקרופיזיולוגיות שהוצגו לאחרונה (MPS) טיפוח אורגנואידים אנושיים צפויים לבצע טוב יותר מאשר בעלי חיים בשלב בדיקות פרה-לקלינליות של תהליך פיתוח תרופות כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. במחקר זה, מחסום המעי האנושי (חיקוי על ידי תרבות שיתופית של תאי Caco-2 ו HT-29) ואת המקבילה בכבד (חיקוי על ידי spheroids עשוי תאי HepaRG מובחן ו תאי סטלה כבד אנושיים) שולבו בשבב שני איברים (2-OC) מכשיר מיקרו-נוזלים כדי להעריך כמה פרצטמול (APAP) פרמקוקינטיקה (PK) ומאפיינים טוקסיקולוגיים. MPS היו שלוש הרכבות: המעי רק 2-OC, כבד רק 2-OC, ו מעיים / כבד 2-OC עם אותה מדיה תפרוק שני אורגנואידים. להערכות PK, אנחנו מינון APAP בתקשורת בנקודות זמן מוגדרות מראש לאחר ניהולו או מעל מחסום המעיים (לחקות את המסלול אוראלי) או במדיה (לחקות את המסלול תוך וריד), ב 12 μM ו 2 μM בהתאמה. דגימות המדיה נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה הפוכה (HPLC). אורגנואידים נותחו לביטוי גנים, לערכי TEER, לביטוי ולפעילות של חלבונים, ולאחר מכן נאספו, תוקנו ונשלחו לערכה של הערכות מורפולוגיות. טכניקת MTT ביצעה היטב בהערכת הכדאיות אורגנואיד, אבל ניתוחי תוכן גבוה (HCA) הצליחו לזהות אירועים רעילים מוקדמים מאוד בתגובה לטיפול APAP. אימתנו כי זרימת המדיה אינה משפיעה באופן משמעותי על ספיגת APAP ואילו זה משפר באופן משמעותי את הפונקציונליות המקבילה לכבד. ספיגת המעיים האנושית APAP וחילוף החומרים של hepatic יכול להיות חיקוי MPS. הקשר בין נתוני MPS ומידול silico יש פוטנציאל גדול כדי לשפר את יכולת החיזוי של שיטות מבחנה ולספק דיוק טוב יותר מאשר מודלים של בעלי חיים במחקרים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים.
Introduction
בשל הבדלים גנומיים ופרוטונומיים, למודלים של בעלי חיים יש ערך חזוי מוגבל למספר תוצאות אנושיות. יתר על כן, הם גוזלים זמן, יקרים ומנוייםמבחינה אתית 1. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית שמטרתה לשפר את העוצמה החזויה ולהפחית את העלויות והזמן שהושקעו בבדיקות פרה-קליניות. הם מכשירים מיקרו-נוזלים המטפחים אורגנואידים (יחידות פונקציונליות של פנטומימטיקה מלאכותית של איברים) תחת זרימת מדיה המקדמת תקשורת אורגנואיד-אורגנואיד. אורגנואידים עשויים תאים אנושיים להגדיל את הרלוונטיותתרגום 2,3,4. MPS צפוי לבצע טוב יותר מאשר ניסויים בבעלי חיים כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. כאשר פונקציונלי באופן מלא, MPS יספק תוצאות משמעותיות יותר, במהירות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר וסיכונים4. קבוצות רבות מפתחות MPS למספר מטרות, במיוחד מודלים מחלה כדי בדיקות היעילות של התרופה.
רמת החשיפה היא אחד הפרמטרים הקריטיים ביותר להערכת יעילות התרופהורעילות 5, 6,7,8,9,10,11,12. MPS מאפשר שילוב אורגנואידים המחקם חשיפה מערכתית וצפוי לבצע טוב יותר מאשר תרבות הרקמה האנושית הדו-מיומסורתית. טכנולוגיה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את החיזוי של ספיגת מעיים מורכבת וחילוף חומרים בכבד4.
MPS שילוב מודל המקבילה האנושית של המעי והכבד היא נקודת התחלה טובה, בהתחשב בתפקיד המרכזי של שני איברים אלה זמינות ביולוגית סמיםוחשיפה מערכתית 13,14,15. APAP היא תרופה אטרקטיבית לחקר MPS ללא שווה ערך לכליות כי חילוף החומרים שלה נעשה בעיקר עלידי הכבד 16,17.
2-OC הוא מכשיר מיקרו-נוזל דו-קאמרי המתאים לתרבות של שתי רקמות/אורגנואידים מקבילים אנושיים שונים המחוברים על ידימיקרו-צינורות 16. על מנת לחקות בינה אנושית אוראלית / תוך ורדי ניהול של תרופה ולהעריך את ההשפעות של שיחה צולבת בין המעי וכבד שווה ערך על פרמקוקינטיקה APAP, מלבד פונקציונליות organoids וכדאיות, שלושה הרכבות MPS שונות בוצעו: (1) “מעיים 2-OC MPS” מורכב שווה ערך מעיים המבוסס על הוספת תרבות המכילה Caco-2 + HT-29 תאים coculture, משולב בהתקן 2-OC; (2) “כבד 2-OC MPS” המורכב מספרואידים כבד עשוי HepaRG + HHSteC (תאי סטלה הכבד האנושי) משולב בהתקן 2-OC; ו(3) “מעיים / כבד 2-OC MPS” מורכב המקבילה המעי בתא התקן אחד תקשורת עם המקבילה הכבד בשנייה על ידי זרימת התקשורת דרך ערוצים microfluidic.
כל ההתמרמרות בוצעו בתנאים סטטיים (ללא זרימה) ודינמיים (עם זרימה) בשל ההשפעה של הגירויים המכניים (דחיסה, מתיחה וגייה) על הכדאיותוהפונקציונליות של התא 18,19,20. המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול עבור הדמיית ניהול אוראלי /תוך ורדי APAP ואת הספיגה / חילוף החומרים בהתאמה וניתוחים טוקסיקולוגיים ב 2-OC MPS המכילים מודלים מקבילים המעי האנושי והכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההערכה המדויקת והאמינה של המאפיינים הפרמקולוגיים של תרופות חדשות חוקרות היא קריטית להפחתת הסיכון בשלבי הפיתוח הבאים. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית, שמטרתה לשפר את הכוח החזוי ולהפחית את העלויות והזמן בילה עם בדיקות פרה-קלינליות. הקבוצה שלנו מתקדמת בהערכת תכונות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר כריסטי Guguen-Guillouzo, ד”ר פיליפ גריפון ביחידה 522 INSERM וד”ר כריסטיאן Trepo ביחידה 271 INSERM לשימוש בחומר הביולוגי (Hepa RG תאים) ועל הפיכתו לאחר מכן זמין עבורנו על מנת לבצע את המחקר האקדמי.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
