Микрофизиологическая система кишечника/печени для фармакокинетической и токсикологической оценки лекарственных препаратов
Summary
Мы подвергли воздействию микрофизиологическую систему (MPS) с органоидами кишечника и печени на ацетаминофен (APAP). В данной статье описаны методы производства органоидов и оценки фармакокинетической и токсикологической собственности АПАП в MPS. В нем также описаны анализы функциональности тканей, необходимые для проверки результатов.
Abstract
Недавно введенные микрофизиологические системы (MPS), культивирующие человеческие органоиды, как ожидается, будут работать лучше, чем животные, на доклинологической фазе испытаний процесса разработки наркотиков, поскольку они генетически являются человеческими и подыгрывать взаимодействию между тканями. В этом исследовании, кишечный барьер человека (эмулируется совместно культуры Caco-2 и HT-29 клеток) и печени эквивалент (эмулируется сфероидов из дифференцированных клеток гепаРГ и человеческих печеночной стеллат клетки) были интегрированы в двухорганический чип (2-OC) микрофлюидное устройство для оценки некоторых ацетаминофен (APAP) фармакокинетических (APAP) MPS было три сборки: кишечник только 2-OC, печень только 2-OC, и кишечник / liver 2-OC с теми же средствами, perfusing обоих органоидов. Для оценок ПК, мы dosed APAP в средствах массовой информации на заданных времени после введения его либо над кишечным барьером (эмуляция устного маршрута) или в средствах массовой информации (эмуляция внутривенного маршрута), на 12 МКМ и 2 МКМ соответственно. Образцы средств массовой информации были проанализированы с помощью жидкой хроматографии высокого давления (HPLC). Органоиды анализировались на экспрессию генов, значения TEER, экспрессию и активность белка, а затем собирали, чинить и подались на набор морфологических оценок. Техника MTT хорошо справились с оценкой жизнеспособности органоидов, но анализы высокого содержания (HCA) смогли обнаружить очень ранние токсичные события в ответ на лечение APAP. Мы проверили, что поток мультимедиа не влияет на поглощение APAP, в то время как он значительно улучшает функциональность эквивалента печени. APAP поглощения кишечника человека и печеночным метаболизмом может быть подражания в MPS. Связь между данными MPS и силико-моделированием имеет большой потенциал для повышения предсказуемости методов in vitro и обеспечения лучшей точности, чем модели животных в фармакокинетических и токсикологических исследованиях.
Introduction
Из-за геномных и протеомных различий модели животных имеют ограниченную прогностический значение для нескольких исходов человека. Кроме того, они относят много времени, дорогие и этическисомнительные 1. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностический мощности и сократить расходы и время, проведенное с доклинических испытаний. Это микрофлюидные устройства, культивирующие органоиды (искусственные миметические функциональные единицы органов) под потоком мультимедиа, который способствует органоидно-органоидной коммуникации. Органоиды из клеток человека увеличивают транстулятнуюактуальность 2,3,4. MPS, как ожидается, будет работать лучше, чем тесты на животных, потому что они генетически человека и повторить взаимодействие между тканями. При полной функциональности, MPS обеспечит более значимые результаты, на более высокой скорости и более низкие затраты ириски 4. Многие группы разрабатывают MPS для нескольких целей, особенно модели заболеваний для проверки эффективности препарата.
Уровень воздействия является одним из наиболее важных параметров для оценки эффективностии токсичности препарата 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS позволяет органоидной интеграции, которая эмулирует системное воздействие и, как ожидается, будет работать лучше, чем традиционные 2D культуры тканей человека. Эта технология может значительно улучшить прогнозирование поглощения соединения кишечника и метаболизма печени4.
MPS интеграции человеческой эквивалентной модели кишечника и печени является хорошей отправной точкой, учитывая центральную роль этих двух органов в биодоступности наркотикови системного воздействия 13,14,15. APAP является привлекательным препаратом для изучения MPS без эквивалента почек, потому что его метаболизация делается восновном печенью 16,17.
2-OC представляет собой двухкамерное микрофлюидное устройство, подходящее для культуры двух различных человеческих эквивалентных тканей/органоидов, взаимосвязанных микроканалами16. Для того, чтобы подражать in vitro человека устные / внутривенное введение препарата и оценить влияние перекрестного разговора между кишечником и печенью эквиваленты на APAP фармакокинетики, помимо функциональности и жизнеспособности органоидов, были выполнены три различных сборки MPS: (1) “Intestine 2-OC MPS”, состоящий из эквивалента кишечника, основанного на культурной вставке, содержащей кокультуру клеток Caco-2 и HT-29, интегрированную в устройство 2-OC; (2) “Liver 2-OC MPS”, состоящий из сфероидов печени, сделанных из HepaRG и HHSteC (Человеческие печеночные клетки Stellate), интегрированные в устройство 2-OC; и (3) “Intestine/Liver 2-OC MPS”, состоящий из эквивалента кишечника в одном отсеке устройства, общаясь с эквивалентом печени в другом потоком средств массовой информации через микрофлюидные каналы.
Все анализы проводились в статических (без потока) и динамических (с потоком) условиях из-за воздействия механических стимулов (сжатие, растяжение и стрижка) на жизнеспособность клеткии функциональные возможности 18,19,20. В настоящей статье описывается протокол для APAP устной / внутривенной эмуляции введения и соответствующих абсорбции / метаболизма и токсикологических анализов в 2-OC MPS, содержащих кишечника человека и печени эквивалентных моделей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точная и надежная оценка фармакологических свойств новых препаратов имеет решающее значение для снижения риска на следующих этапах развития. MPS является относительно новой технологией, которая направлена на улучшение прогностической мощности и сокращение затрат и времени, затраченн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Кристи Гуген-Гийозо, д-ра Филиппа Грипона в подразделении 522 INSERM и доктора Кристиана Трепо в подразделении 271 INSERM за использование биологического материала (клетки Hepa RG) и за то, что он был доступен для нас для проведения научных исследований.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
