약물 약동 및 독성 평가를 위한 장/간 미생물학 시스템
Summary
우리는 아세트아미노펜 (APAP)에 장과 간 오르가노이드를 가진 미생물 계통 (MPS)를 드러나. 이 문서에서는 MPS의 오르가노이드 생산 및 APAP 약동 및 독성 특성 평가를 위한 방법을 설명합니다. 또한 결과를 검증하는 데 필요한 조직 기능 분석을 설명합니다.
Abstract
최근에 도입된 미생물시스템(MPS)은 인간 유기체를 육성하는 것이 유전적으로 인간적이고 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 약물 개발 과정의 전임상 시험 단계에서 동물보다 더 나은 성능을 발휘할 것으로 예상된다. 본 연구에서, 인간 장 장벽(Caco-2 및 HT-29 세포의 공동 배양에 의해 에뮬레이트됨) 및 간 등가(분화된 HepaRG 세포 및 인간 간 석래 세포로 만든 스페로이드에 의해 에뮬레이트됨)는 일부 아세트아핀(Pcoinophen)을 평가하기 위해 2기관 칩(2-OC) 미세 유체 장치로 통합되었다. MPS는 세 개의 어셈블리를 했다: 장 만 2-OC, 간 만 2-OC, 그리고 내장/간 2-OC 두 오르가노이드를 perfusing 동일한 미디어와. PK 평가를 위해, 우리는 12 μM및 2 μM에서 장 장벽 (경구 경로를 에뮬레이션) 또는 매체 (정맥 경로를 에뮬레이션)를 통해 그것을 관리 한 후 사전 설정 된 시점에서 미디어에 APAP를 투여했습니다. 미디어 샘플은 반전 단계 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석되었다. 오르가노이드는 유전자 발현, TEER 값, 단백질 발현 및 활성을 위해 분석한 다음 형태학적 평가 집합에 수집, 고정 및 제출하였다. MTT 기술은 오르가노이드 생존가능성을 평가하는 데 잘 수행되었지만, 높은 함량 분석(HCA)은 APAP 처리에 응하여 매우 초기 독성 이벤트를 감지할 수 있었습니다. 우리는 미디어 흐름이 APAP 흡수에 크게 영향을 미치지 않는 반면 간 동등한 기능을 크게 향상시키는지 확인했습니다. APAP 인간 장 흡수 및 간 물질 대사 MPS에 에뮬레이트 될 수 있습니다. MPS 데이터와 실리코 모델링 의 연관성은 체외 방법의 예측 가능성을 개선하고 약동 및 독성 연구에서 동물 모델보다 더 나은 정확도를 제공 할 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
유전체학 및 프로테오믹 차이로 인해 동물 모델은 여러 인간의 결과에 대한 예측 가치가 제한적입니다. 또한, 그들은 시간이 많이 소요, 비싸고 윤리적으로 의심1. MPS는 예측 능력을 개선하고 임상 전 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 그들은 오르가노이드 오르가노이드 통신을 촉진하는 미디어 흐름하에서 오르가노이드 (장기의 인공 마메틱 기능 단위)를 육성하는 미세 유체 장치입니다. 인간 세포로 만든 오르가노이드는 번역 관련성2,3,4를증가시다. MPS는 유전적으로 인간이며 조직 간의 상호 작용을 재구성하기 때문에 동물 실험보다 더 잘 수행 될 것으로 예상됩니다. 완벽하게 작동하면 MPS는 더 높은 속도로 더 의미 있는 결과를 제공하고 비용과 위험을4로낮출 것입니다. 많은 그룹은 여러 목적을 위해 MPS를 개발하고 있다, 특히 질병의 모델은 약물의 효능을 테스트.
노출 수준은 약물 효능 및 독성5,6,7,8,9,10,11,12를평가하기 위한 가장 중요한 매개변수 중 하나입니다. MPS는 전신 노출을 에뮬레이트하는 오르간성 통합을 허용하고 전통적인 2D 인간 조직 배양보다 더 잘 수행 될 것으로 예상된다. 이 기술은 화합물 장 흡수 및 간 대사4의예측을 크게 향상시킬 수 있습니다.
장과 간의 인간 동등한 모델을 통합하는 MPS는 약물 생체 이용률 및 전신 노출13,14,15에서이 두 기관의 중심 역할을 고려하여 좋은 출발점이다. APAP는 신장과 동등한 신장이 없는 MPS를 연구하기 위한 매력적인 약물로, 대사화는 주로 간16,17에의해 수행된다.
상기 2-OC는마이크로채널(16)에의해 상호 연결된 두 개의 상이한 인간 동등한 조직/오르가노이드의 배양에 적합한 2챔버 미세유체 장치이다. 약물의 체외 인간 구두/정맥 투여를 모방하고 APAP 약동학에 대한 장과 간 등가물의 교차 이야기의 효과를 평가하기 위해, 오르가노이드 기능성 및 생존가능성 외에도, 3개의 다른 MPS 어셈블리가 수행되었다: (1) Caco-2 + HT-29 세포 공동 배양을 포함하는 배양 삽입에 기초한 장 등가물로 구성된 “내장 2-OC MPS”, 2-OC 장치에 통합; (2) 2-OC 장치에 통합된 HepaRG + HHSteC(인간 간 Stellate 세포)로 구성된 간 스페로이드로 구성된 “간 2-OC MPS”; 및 (3) “내장/간 2-OC MPS”는 마이크로 유체 채널을 통해 매체흐름에 의해 다른 장치 구획과 동등한 간구획으로 구성된다.
모든 아세이는 기계적 자극(압축, 스트레칭 및 전단)의 충격으로 인해 정적(유동 없음) 및 동적(흐름 없음) 조건하에서 수행되었다(압축, 스트레칭 및 전단) 세포 생존능력 및기능성(18,19,20). 본 기사는 인간 장 및 간 등가 모델을 포함하는 2-OC MPS에서 APAP 경구/정맥 투여 에뮬레이션 및 각각의 흡수/물질 대사 및 독성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조사 신약의 약리학적 특성에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 평가는 다음 개발 단계의 위험을 줄이는 데 중요합니다. MPS는 예측 능력을 개선하고 전임상 테스트에 소요되는 비용과 시간을 줄이는 것을 목표로 하는 비교적 새로운 기술입니다. 우리 그룹은 납 최적화에 주로 필요한 약동및 독성 특성의 평가에 발전하고 있습니다. 우리는 두 개의 챔버가있는 2-OC 미세 유체 장치와 협력하여 두 개의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 크리스티 구겐 -기요루조 박사, 단위 522 INSERM에서 박사 필립 그리폰과 생물 물질의 사용을위한 단위 271 INSERM에서 박사 크리스티안 트레포에 감사하고 학술 연구를 수행하기 위해 우리를 위해 다음 사용할 수 있도록.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
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