כאן, אנו מציגים חמצן הדרגתי ektacy, שיטה מהירה ומחודשת כדי למדוד דם אדום דפורמביליות בדגימות מחולים עם מחלת המגל תאים תחת הדלקת החמצן מבוקרת והחמצון. טכניקה זו מספקת דרך ללמוד את תא הדם האדום מחליא ולפקח על יעילות הטיפול במחלות תאים.
ב מחלת התא מגל (SCD), מוטציה בנקודה אחת בקידוד הגן עבור בטא-המוגלובין גורם לייצור של ההמוגלובין נורמלי S (HbS). כאשר הדחמצן, HbS יכול לפולימו, ויצרו מוטות נוקשה של המוגלובין, וכתוצאה מכך הבחילה של כדוריות הדם האדומות (RBCs). RBCs מחליא אלה הפחיתו באופן משמעותי deformability, גורם vaso-הסגר, אשר מוביל רבות SCD הקשורות לסיבוכים קליניים, כולל כאב, שבץ, ונזק איברים. הפחתת היכולת של RBC מופחתת גם על ידי התייבשות RBC, וכתוצאה מכך תאי דם אדומים צפופים כי נוטים יותר למגל. עד כה, אין שיטת יחיד זמין, מהירה, וממעבדה הניתנת לחיזוי מסוגל לחזות את חומרת המחלה או ניטור ישיר של אפקטי הטיפול עבור הרומן, הלא עוברי המוגלובין לטיפולים. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדוד rbc דפורמביליות כפונקציה של פו2 המאפשר כימות של התנהגות מבחילה בחולים scd. החמצן הדרגתי מודד מדדים RBC deformability, המבוטא כמדד התארכות (EI), כפונקציה של פו2. RBCs חשופים למתח הטיה קבוע של 30 אבא במהלך סיבוב אחד של החמצון והחמצון. שישה פרמטרים לבדיקה מיוצרים. מתוך אלה, הנקודה של מחליא (PoS), מוגדר כ-pO2 שבו ei מקסימום (eimax) מראה 5% ירידה, ומינימום ei במהלך deחמצון(ei)הם אינפורמטיביים ביותר, המשקף את הפו האדם של החולה2 שבו והיעדר מחלות מינימליות של כדוריות הדם האדומות של המטופל, בהתאמה. PoS קשורה לזיקה המוגלובין של מטופל יחיד עבור חמצן, ואילו EImin מראה מתאם חזק עם רמות המוגלובין העובר. אנו מסיקים כי מעבר חמצן ektacy, הוא טכניקה מבטיחה לפקח על הטיפול בחולים עם SCD, כמו בסמנים עבור סוכני אנטי מחליא בניסויים קליניים, טרום קלינית, וכלי חשוב ללמוד התנהגות מבחילה של RBCs מ אנשים עם תכונות SCD ותאים מגל.
ב SCD, נקודה אחת מוטציה תוצאות הייצור של HbS, אשר יכול לפולימד על הדגנציה. HbS פילמור גורמת לבחילה של RBCs ומפחית RBC deformability. השילוב של RBC מחליא ודבקות RBC האנדותל מוביל לסיבוכים SCD שונים, כולל vaso-משברים הסגר (VOC), שבץ, נזק איברים, ואנמיה המוליטית כרונית. אפילו בתנאים normoxic, rbc דפורמביליות הוא נפרץ בחולים עם scd. הדיפורביליות נמוכה יותר בריכוזי חמצן נמוכים. שחקני מפתח הקובעים את הדפורמביליות בנורמוסיה הם תאים צפופים, תאים בעלי הפיכה מבחילה (isc), ותאים יבשים, שכולם בעלי יחס משטח לנפח מופחת1,2,3.
Ektacyמנסה היא שיטה הוקמה למדוד RBC deformability, בשימוש נרחב לאבחנה של אנסיאס המוליטית תורשתית, במיוחד membranopathies4. זה יכול לשמש גם כדי ללמוד hemorheology5,6,7,8,9. אוסמוטי הדרגתי ektacy try, שבו rbc דפורמביליות נמדד במהלך שינוי מתמשך ב osmolality, שימש ללמוד scd במשך עשורעשר,11. אחוז המוגלובין העובר (HbF) הוא אחד החזקים מעכבי של Hbf פולימור כי לא HbF ולא היברידית מעורבת שלה (∝ 2βSγ) יכול להיכנס לשלב הפולימר deoxyHbS12. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי הגדלת רמות hbf בחולים scd מוביל ליחס משטח טוב יותר לנפח, ובכך לשפר את מצב המים, ובכך את דפורמביליות בחולים שאינם התמזגו11.
Rbc דפורמביליות נחקרו בעבר כמו סמנים עבור סיבוכים scd, אבל עם תוצאות סותרות. במחקרים המבוצעים באמצעות הצלבה ובמצב יציב, אנשים עם רמות גבוהות יותר של rbc דפורמביליות נמצאו שכיחות גבוהה יותר של אוסטאופהרופזיס ועוד משברים כאב13,14,15. בניגוד לממצאים אלה, בהשוואה לערכי המצב הקבוע במהלך VOC חריפה, rbc דפורמביליות ירד במחקרים האורך בתוך אותם אנשים16. פער זה עשוי להיות תוצאה של לימוד RFORMABILITY בתנאים שונים (כלומר, במהלך המצב הקבוע לעומת VOC). האחוז של התאים מחליא הוא גבוה בתחילת VOC והתאים נהרסים במהירות כמו המשבר מתקדם, אשר עשוי להסביר את ההבדל בין המצב היציב החוצה המדינה מקרה נתונים ונתונים האורך המתקבל במהלך VOC. עם זאת, גורמים אחרים, כגון דבקות של אוכלוסיות משנה RBC למשטח האנדותל, עשויים גם להיות חשובים בהתרחשות של VOC. ב scd, זה רלוונטי יותר קלינית כדי למדוד את דפורמביליות במהלך החמצון, כי vaso-הסגר בדרך כלל מתרחשת בארוי postcapillary והוא לא ברשת פחות ארוי מיקרוקפילר17. בנוסף, הנוכחות של ISCs עשויה לשנות את היכולת של ektacytometer כדי למדוד את הדפורמביליות ב normoxia. עיוות של תבנית עקיפה נגרמת על ידי iscs, הנובעת מחוסר היישור במהלך הזרימה1,2,3.
גישות חלופיות כדי ללמוד את הפתופסולוגיה של VOC כוללים מדידות של הדבקות RBC משטח מלאכותי18, תא יחיד העכבה מיקרופלו cy, מיקרו מודלים מבוססי מיקרופלואידיג19, מבוססות microflu, מודל מבוסס שילוב כמותי מדידות התא מחליקות ומחליקות עם תא בודד מבית מדידה20, ופילמור המושרה לייזר21. למרות ההבטחות, טכניקות אלה יקרות, עבודה אינטנסיבית, דורש הכשרה מפעיל נרחב. בנוסף, התשובה היא כי הם מבוססי מורפולוגיה חוסר יכולת ללמוד התנהגות תאית, כגון deformability, כפונקציה של מעבר חמצן.
במחקר זה, אנו מתארים שיטת מהירה ופונקציונלית תפקודית שבוצעה עם ektacytometer טר. זהו מדידה הדור הבא ektacy, אשר מודד את ההיבטים האיכותניים השונים של rbc דפורמביליות התבטא כמו EI במהלך הדחמצן (1,300 s) ו-החמצן מהירה (280 s). אלה מרווחי זמן לאפשר היווצרות פולימר HbS, ובכך התרחשות של שינויים מורפולוגיים ולאחר מכן התאוששות. הדלקת החמצן מתרחשת על ידי החדרת גז חנקן, אשר מקטין באיטיות את המתח בדגימת הדם בפער שבין בוב והספל של האקטקטומטר. Rbc דפורמביליות נמדד ברציפות בזמן מתח החמצן נמדד כל 20 s באמצעות מקום קטן O2-ספוט בקיר של הספל. במהלך המבחן, כ 80 pO2 מדידות מצמידים את ה-EI מדוד באותו רגע. לחץ החמצן יורד מתחת ל -20 מטרים במהלך הטומאה, והחמצן מונחה על ידי הדיפוזיה הפסיבית של האוויר הסביבתי. הכיוונון הניסיוני של מודול המערכת הבין-מדרגתי והחמצן מוגדר באיור 1 ובאיור 2. העיקרון של ektacy, מבוסס על פיזור RBC המושרה של אור מקרן לייזר. התוצאה היא תבנית עקיפה אליפטית בעת החלת לחץ הטיה באותו זמן (איור 1).
כאן אנו מתארים מעבר חמצן ektacy, שיטה שיכולה לשמש כדי ללמוד את ההתנהגות החולנית של כדוריות דם אדומות מחולים SCD תחת מגוון של ריכוזי חמצן (איור 4 ואיור 5). כדי להשיג תוצאות שאינן מזדהות, חשוב לזהות את הגורמים המשפיעים על התוצאות. למשל, הטמפרטורה יש השפעה גדולה על RBC deformability, בעיקר בשל השפעותיו על העובי של הפתרון הצמיגי (PVP). אנו ממליצים לבצע מדידה בדיקה בתחילת היום כדי לחמם ביסודיות את המכונה עד 37 ° c. פעולה זו תשפר את השגות התוצאות. האוסמולציה של הפתרון הצמיגי צריך להיות בטווח הצר (282 – 286 mOsm/ק ג עבור PVP), כי משפיע על מעמד היום לחות, אשר בתורו משפיע על RBC deformability. ה-pH ו צמיגות של PVP צריך גם להיות מוסדר היטב. הבדלים ב-pH ובטמפרטורה יכולים להשפיע על עקומות באופן דרמטי22. בנוסף, המים הנותרים בספל, בבוב ובצינורות, עלולים לגרום לפירוק של RBCs, ובכך להביא לנתונים שגויים, מכיוון שפחות RBCs בספל הנוכחי יימדד.
ניתן לכוונן הגדרות כדי לבצע שאלות מסוימות לגבי מעבר חמצן. הגדרות מועדפות מפורטות בטבלה 1. זמן הדחמצן של 1,300 s נבחר על בסיס תצפיות המראים כי הארכת הדחמצן לא התוצאה היא EI נמוך יותר עבוררוב המטופלים . לעומת זאת, קיצור הזמן לחוסר החמצן היה מעכב את הכוח המבדיל של החמצן מעבר האנרגיה. זמן החמצון הוגדר 280 s בשל הפתרון המהירות של הפולימרים HbS במהלך החמצן, ושחזור במקביל של EI לעבר ערכים שנמדדו לפני הדחמצון. מתח הטיה הוגדר ל-30 Pa, שהיא אנלוגית ל-אוסמוטי הדרגתי. הנמכת פרמטר זה עלולה לעכב את הכוח המבדיל. ניתן להשתמש בבקרת הדחמצן אם מערכת מהירות החמצון מוחלת על כל דגימת מטופל. בהגדרות המועדפות שלנו, אפשרות זו הוחלפה מכיוון שקצב הדחמצן הוא ספציפי למטופל בשל עקומת דיסוציאציה ייחודית של המוגלובין. מכאן, החלפת בקרת החמצון מבטלת את התכונה הזאת מהשיטת הפעולה. עם זאת, תכונה זו של מעבר החמצן ektacy, הוא עדיין תחת חקירה.
מספר גורמים ידועים המשפיעים על הדרגתי הפרמטרים ektacy, כלומר pH, טמפרטורה, ו-osmolarity. Ektacy, במיוחד PoS, הוא מושפע 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)22. כמו כן, קיים קורלציה ברורה בין% HbF לבין ה-EImin, ובמידה פחותה יותר של PoS (איור 5a–D). EImax קשורה לתאי מגל ב normoxia, אשר יכול להסביר את התצפית כי זמן קצר לאחר VOC, rbc דפורמביליות ב normoxia (EImax), הוא גבוה יותר. האחרון נגרם על ידי הרס של תאים מחליא ביותר, ומכאן RBCs פחות deformable במהלך VOC16. כפי שמוצג באיור 5F, גבוה יותר% ברבורי צפיפות (המוגדרים כ-rbcs עם ריכוז המוגלובין ≫ 1.11 mg/mL) מוגדרים בחוזקהעם EI נמוך יותר. הדבר מצביע על כך שתאים צפופים הם גורם חשוב ב-rbc דפורמביליות בנורמוקסיה, בדומה לתוצאות שדווחו בעבר1.
סטנדרטיזציה של דגימות חשוב מאוד להשגת תוצאות הגנוזה ולהבחנה בין גנוטיפים שונים וטיפולים. התיקון עבור ספירת RBC חשוב, מאחר שהמספר של RBCs משפיע על עוצמת דוגמת העקיפה. אם מספרי RBC התחתון נמצאים בפער בין בוב והספל, העיקול יהיה לנוע כלפי מעלה ושמאלה. בנוסף, העקומה להשתנות, חישוב מדויק של הפרמטרים, במיוחד את ה-PoS.
מגבלה של טכניקה זו היא שערך ה-EI מייצג ממוצע של כל התאים, לרבות אוכלוסיות משנה שונות. טרוגניות של אוכלוסיות RBC בחולים SCD והשפעתה על המדידה ektacy, כבר נחקרו באופן אינטנסיבי. פעולה זו הביאה לסטנדרטיזציה שבה גודל תבנית העקיפה מותאמת לערך קבוע במקום לתקן את ספירת ה-rbc23,24. בין אם דרך זו של סטנדרטיזציה צריך גם להיות מיושם על מדידת חמצן ektacy, מדידות המדידה נמצאת כעת במחקר.
כמה טכניקות למדוד rbc דפורמביליות תחת ארוי תנאים פותחו בהתבסס על צעד הדחמצן שהתרחש מחוץ ektacytomrra25,26,27. בתנאים אלה, הבדלים בהתנהגות הסלולר לא נצפו בין חולים עם תכונות HbS בקרות בריאות תחת pH פיסיולוגיים25. עם זאת, הדרגתי החמצן מראה בבירור מעולה נמוך אך ברור אצל אנשים עם תכונות HbS (איור 4א). עד היום, בפרקטיקה הקלינית השוטפת, השיטות החלופיות היחידות למדידת הנטייה של RBCs של מטופל יחיד למגל בתחום החוץ, כוללות מכלול מבוסס מורפולוגיה: RBCs מודדות בתנאים המקדמים את ה-HbS פולימור, כגון מתח חמצן נמוך או pH נמוך. התוספת מתווספת לאחר הדגירה ואחוז התאים המבחילה הוא באופן ידני או דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ אור. ניסויים מוקדמים רבים טרום קלינית ומוקדם שלב השימוש הטיפול מחליא ליצור משתנה תוצאה משנית כדי להיות מסוגל לחזות את היעילות הקלינית ב-scd28,29,30,31 ,32 עם זאת, זה זמן רב, השונות גבוהה ורגישות נמוכה, הטכניקה אינה אוטומטית, ולכן, עבודה אינטנסיבית. יתר על כן, שינויים מורפולוגיים עקב מחלות לא יכול להתאים היטב עם פרמטרים פיזיולוגיים, כמו RBC deformability, משום שהיא שיטת 2-מימדי סטטי2.
מעבר החמצן הדרגתי מספק מינון תפקודי של מחלות שהוא מהיר ומלא מתפקד. זהו מבחן בלתי מתורבת שאינו מחשיב את משטח האנדותל. עם זאת, הוא מספק היבטים פונקציונליים של התנהגות חולנית ומאפייני RBC, מה שהופך אותה טכניקה מבטיחה עבור מחקרי תאים מגל. היישומים העתידיים של הטכניקה כוללים ניטור יעילות הטיפול בחולים SCD, המשמש בסמנים עבור אסטרטגיות טיפול חדשות, לימוד התנהגות מבחילה, וניטור הצ לאחר השתלת תא הגזע SCD.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענק יורוסטארס estar18105 ועל ידי מענק בלתי מוגבל שסופקו על ידי RR מכטרוניקה. המחברים מודים לסיסטו נדריקס וליאן דה זוטן על תמיכתם הטכנית.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |