Burada, orak hücre hastalığı olan hastalardan alınan örneklerde kontrollü deoksijenasyon ve reoksijenasyon altında kırmızı kan hücresi deformitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem olan oksijen gradyan ektasitattrisi saklıdır. Bu teknik kırmızı kan hücresi orması çalışma ve orak hücre hastalığı tedavi etkinliğini izlemek için bir yol sağlar.
Orak hücre hastalığında (SCD), beta-globin için gen kodlamasında tek bir nokta mutasyonu anormal hemoglobin S (HbS) üretimine neden olur. Ne zaman deoxygenated, HbS polimerize olabilir, hemoglobin sert çubuklar oluşturan, kırmızı kan hücrelerinin hastalanması ile sonuçlanan (RBC). Bu hasta RBC’ler deformiteyi önemli ölçüde azaltarak vazo-oklüzyona neden olmuş, bu da ağrı, inme ve organ hasarı gibi SCD’ye bağlı çok sayıda klinik komplikasyona yol açmıştır. RBC deformite deremi de RBC dehidratasyon ile azalır, orak olasılığı daha yoğun kırmızı kan hücreleri ile sonuçlanan. Bugüne kadar, hastalığın şiddetini tahmin etme veya yeni, fetal olmayan hemoglobin indükleyici tedavilerin tedavi etkilerini doğrudan izleyebilen tek bir yaygın, hızlı ve tekrarlanabilir laboratuvar testi yoktur. Bu çalışmada, SCD hastalarında hastalık lı davranışların ölçülmesine olanak tanıyan pO2’nin bir fonksiyonu olarak RBC deformitesini ölçen bir protokol açıklatılmıştır. Oksijen gradyan ektasittometrisi, pO2’ninbir fonksiyonu olarak uzama indeksi (EI) olarak ifade edilen RBC deformitesini ölçer. RBC’ler bir tur deoksijenasyon ve reoksijenasyon sırasında 30 Pa’lık sabit bir kesme stresine maruz kalırlar. Altı okuma parametresi üretilir. Bunlardan, maksimum EI ‘nin (EImax)%5 oranında azaldığı pO2 olarak tanımlanan oriling noktası (PoS) ve deoksijenasyon sırasında minimum EI (EImin)en bilgilendirici olan hasta, tek bir hastanın pO2’sini yansıtan hastalanma başlar ve hastanın kırmızı kan hücrelerinin minimal deforme edilebilirlik, sırasıyla. PoS oksijen için bireysel bir hastanın hemoglobin yakınlığı ile ilişkilidir, EImin fetal hemoglobin düzeyleri ile güçlü bir korelasyon gösterir ise. Oksijen gradyan ektasittometrisinin, klinik ve preklinik çalışmalarda hastalık önleyici ajanlar için bir biyomarker olarak SCD’li hastaların tedavisini izlemek için umut verici bir teknik olduğu ve RBC’lerin hastalanma davranışlarını incelemek için önemli bir araç olduğu sonucuna varıyoruz. SCD ve orak hücre özellikleri olan bireyler.
SCD’de tek bir nokta mutasyonu HbS üretimiyle sonuçlanır ve bu mutasyon oksijensizleşme üzerine polimerleşebilir. HbS polimerizasyonu RBC’lerin hastalaşmasına neden olur ve RBC deformitülebilirliğini azaltır. RBC hastalanma ve RBC endotel bağlılık kombinasyonu vazo-oklüzif krizler de dahil olmak üzere çeşitli SCD komplikasyonlara yol açar (VOC), inme, organ hasarı, ve kronik hemolitik anemi. Normoksik koşullarda bile SCD’li hastalarda RBC deformitesi tehlikeye girer. Düşük oksijen konsantrasyonlarında deforme edilebilirlik daha da azalır. Normoksia dedeability belirlemek anahtar oyuncular yoğun hücreler, geri dönüşümsüz hasta hücreler (ISC), ve susuz hücreler, hepsi azalmış yüzey-hacim oranı1var,2,3.
Ektasitometri RBC deformite ölçmek için kurulmuş bir yöntemdir, yaygın kalıtsal hemolitik anemi tanısı için kullanılan, özellikle membranopatiler4. Ayrıca hemorheyoloji 5 ,6,7,8,9çalışma için kullanılabilir. Osmotik gradyan ektasitatomi, hangi RBC deformite osmolalite sürekli bir değişim sırasında ölçülür, on yıl içinde SCD çalışması için kullanılmıştır10,11. Fetal hemoglobin (HbF) yüzdesi HbS polimerizasyonunun en güçlü inhibitörlerinden biridir çünkü ne HbF ne de karışık hibrid tetramer (2βSγ) deoksiHbS polimer faz12’yegiremez. Son çalışmalar, SCD hastalarında HbF düzeylerinin artmasının daha iyi bir yüzey-hacim oranına yol açtığını, böylece hidrasyon durumunuve dolayısıyla transaşık olmayan hastalarda deforme edilebilirliği iyileştirdiğini göstermektedir11.
RBC deformite scd komplikasyonlar için bir biyomarker olarak geçmişte çalışılmıştır, ancak çakışan sonuçlar ile. Kesitsel ve sabit bir durumda yapılan çalışmalarda, RBC deformite yüksek düzeyde olan bireylerin osteonekroz ve daha fazla ağrı krizleri daha yüksek bir insidansı olduğu bulunmuştur13,14,15. Bu bulguların aksine, akut VOC sırasında sabit durum değerleri ile karşılaştırıldığında, Aynı bireyler de uzunlamasına çalışmalarda RBC deformite sasürür16. Bu tutarsızlık, farklı koşullar altında RBC deformitesinin incelenmesinin bir sonucu olabilir (yani, VOC’ye karşı sabit durumda). Hasta hücrelerin yüzdesi bir VOC başında yüksek ve hücreler hızla kriz ilerledikçe yok edilir, hangi voc sırasında elde edilen sabit devlet kesitsel insidans verileri ve longitudinal veri arasındaki farkı açıklayabilir. Ancak, RBC alt popülasyonlarının endotel yüzeyine yapışması gibi diğer faktörler de VOC oluşumunda önemli olabilir. SCD’de, vazo-oklüzyon genellikle hipoksik postkapiller venüllerde meydana gelir ve daha az hipoksik mikrokapiller ağ 17 değil, dejenere olma sırasında deformiteölçmek için klinik olarak daha önemlidir17. Ayrıca, ISC’lerin varlığı normoksia deformite ölçmek için bir ektasitometre yeteneğini değiştirebilir. Kırınım deseninin bozulması ISC’lerden kaynaklanır, bu da akışsırasındahizalamazneden olur 1,2,3.
VOC patofizyolojisi çalışma için alternatif yaklaşımlar yapay bir yüzeye RBC bağlılık ölçümleri içerir18, tek hücreli elektrikempedanmikroakış sitometri19, kantitatif birleştiren mikroakışkan tabanlı modeller tek hücreli reoloji ile hasta ve hasta olmayan hücre ölçümleri20, ve lazer kaynaklı polimerizasyon21. Umut verici olmasına rağmen, bu teknikler pahalı, emek yoğun ve kapsamlı operatör eğitimi gerektirir. Buna ek olarak, morfoloji tabanlı tahliller bir oksijen gradyan bir fonksiyonu olarak, deformability gibi hücresel davranış çalışma yeteneği eksikliği.
Bu çalışmada ektasitometre ile yapılan hızlı ve tekrarlanabilir fonksiyonel bir testi tanımladık. Bu, deoksijenasyon (1.300 s) ve hızlı reoksijenasyon (280 s) sırasında EI olarak ifade edilen RBC deformitesinin farklı nitel yönlerini ölçen yeni nesil ektasitometri ölçümüdür. Bu zaman aralıkları HbS polimer oluşumu için izin, ve böylece morfolojik değişikliklerin oluşumu ve daha sonra kurtarma. Deoksijenasyon azot gazı tanıtılarak oluşur, hangi yavaş yavaş ektasitometre bob ve fincan arasındaki boşlukta kan örneğindeki oksijen gerginliği ni azaltır. RBC deforme edilebilirliği sürekli olarak ölçülürken, oksijen gerilimi her 20’de fincanın duvarında bulunan küçük bir O2-noktaile ölçülür. Test sırasında, yaklaşık 80 pO2 ölçümleri o anda ölçülen EI ile birleştiğinde. Oksijen basıncı deoksijenasyon sırasında 20 mmHg’nin altına düşer ve ortam havasının pasif difüzyonu ile oksijenlenme kolaylaştırılır. Ektasitometre ve oksijen gradyan ektasitometri modülünün deneysel kurulumu Şekil 1 ve Şekil 2’deaçıklanmıştır. Ektasitometri prensibi bir lazer ışınından ışığın RBC kaynaklı saçılma dayanmaktadır. Bu durum, kesme gerilimi aynı anda uygulandığında eliptik kırınım deseni ile sonuçlanır (Şekil 1).
Burada oksijen gradyan ektasittometri, oksijen konsantrasyonları bir dizi altında SCD hastalarından kırmızı kan hücrelerinin hasta davranışını incelemek için kullanılabilecek bir yöntem(Şekil 4 ve Şekil 5)açıklar. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, sonuçları etkileyen faktörleri belirlemek önemlidir. Örneğin, sıcaklık RBC deformite üzerinde büyük bir etkisi vardır, çoğunlukla viskoz çözelti (PVP) kalınlığı üzerindeki etkileri nedeniyle. Makineyi 37 °C’ye iyice ısıtmak için günün başında bir test ölçümü yapmanızı öneririz. Bu, sonuçların tekrarlanabilirliğini artıracaktır. Viskoz çözeltinin ozmolaritesi dar bir aralıkta olmalıdır (PVP için 282-286 mOsm/kg), çünkü osrüleritasyon durumunu etkiler, bu da RBC deformitesini etkiler. PVP’nin pH ve viskozitesi de sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. pH ve sıcaklık farklılıkları eğrileri önemli ölçüde etkileyebilir22. Ayrıca, bardakta kalan su, bob, ve tüpler, RBC’lerin lysis neden olabilir, bu nedenle yanlış veri ile sonuçlanan, fincan mevcut daha az bozulmamış RBC’ler ölçülecektir çünkü.
Oksijen gradyan ektasittometrisi yapmak için ayarlar belirli araştırma sorularını ele alacak şekilde ayarlanabilir. Tercih edilen ayarlar Tablo 1’delistelenmiştir. 1.300 s’lik bir oksijensizleşme süresi, oksijensizleşmenin uzaması birçok hasta için daha düşük bir EImin ile sonuçlanmadığını gösteren gözlemlere dayanarak seçilmiştir. Buna karşılık, deoksijenasyon süresinin kısaltılması oksijen gradyan ektasittometrisinin ayırıcı gücünü engelleyebilir. Reoksijenasyon süresi, reoksijenasyon sırasında hızla çözülen HbS polimerleri ve ei’nin deoksijenasyon dan önce ölçülen değerlere doğru birlikte geri getirilmesi nedeniyle 280 s olarak belirlenmiştir. Kesme gerilimi 30 Pa olarak ayarlandı, bu da ozmotik gradyan ektasitometriye benzer. Bu parametreyi düşürmek ayrımcı gücü engelleyebilir. Her hasta örneğine bir dizi oksijensizasyon hızı uygulanırsa deoksijenasyon kontrolü kullanılabilir. Tercih edilen ayarlarımızda, bu seçenek, benzersiz hemoglobin ayrışma eğrisi nedeniyle oksijensizleşme oranı hastaya özgü olduğu için kapatıldı. Bu nedenle, deoxygenation kontrolü anahtarlama bu karakteristik bağırsak ortadan kaldıracağını. Ancak, oksijen gradyan ektasittometri bu özelliği hala araştırılıyor.
Birçok iyi bilinen faktörler oksijen gradyan ektasittometri parametreleri etkiler, yani pH, sıcaklık, ve ozolarite. Ektasitometri, özellikle PoS, 2,3-difosfogliserin (2,3-DPG)22etkilenir. Ayrıca, %HbF ile EIminarasında açık bir korelasyon vardır ve daha az bir ölçüde PoS(Şekil 5A–D). EImax normoxia orak hücreleri ile ilişkilidir, hangi gözlem açıklayabilir kısa bir VOC sonra, normoksia RBC deformite (EImax),daha yüksektir. İkincisi en hasta hücrelerin imha neden olur, ve dolayısıyla voc sırasında daha az deformable RBC16. Şekil 5F’degösterildiği gibi , daha yüksek %yoğun RBC ‘ler (hemoglobin konsantrasyonu >1.11 mg/mL olan RBC’ler olarak tanımlanır) daha düşük EImaxile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu, daha önce bildirilen sonuçlara benzer şekilde normoksiada yoğun hücrelerin RBC deformitesinde önemli bir faktör olduğunu gösterir1.
Numunelerin standardizasyonu, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve farklı genotipler ile tedaviler arasında ayrım sağlamak için çok önemlidir. RBC sayısı kırınım deseninin yoğunluğunu etkilediğiiçin RBC sayısının düzeltilmesi önemlidir. Bob ve bardak arasındaki boşlukta daha düşük RBC numaraları varsa, eğri yukarı ve sola doğru hareket edecektir. Ayrıca, eğri dalgalanacak ve parametrelerin, özellikle pos’un doğru hesaplanmasını engelleyecektir.
Bu tekniğin bir sınırlama sı, EI değeri farklı alt popülasyonlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerin ortalamasını temsil eder. SCD hastalarında RBC popülasyonlarının heterojenliği ve ektasittometri ölçümü üzerindeki etkisi yoğun olarak araştırılmıştır. Bu, kırınım deseninin boyutunun RBC sayısı23,24için düzeltilmiş yerine sabit bir değere ayarlandığı standardizasyonla sonuçlandı. Oksijen gradyan ektasittometri ölçümlerine bu şekilde standardizasyon uygulanıp uygulanmayacağı halen çalışMaktadır.
Hipoksik koşullar altında RBC deformiteölçmek için çeşitli teknikler ektasitometre dışında gerçekleşti bir deoksijenasyon adımı dayalı geliştirilmiştir25,26,27. Bu şartlar altında HbS özelliği olan hastalar ile fizyolojik pH25altında sağlıklı kontroller arasında hücresel davranış farklılıkları gözlenmemiştir. Oksijen gradyan ektasittometrisi, ancak HbS özelliği olan bireylerde düşük ama belirgin PoS gösterir (Şekil 4A). Bugüne kadar, rutin klinik uygulamada, tek bir hastanın RBC’lerinin in vitro orak eğilimini ölçmek için tek alternatif yöntem morfoloji tabanlı hastalanma tetkiki içerir: KBC’ler HbS polimerizasyonunu teşvik eden koşullar altında kuluçkaya yatırılır, örneğin düşük oksijen gerilimi veya düşük pH. Kuluçka sonrası bir fiksatif eklenir ve hasta hücrelerin yüzdesi ışık mikroskobu kullanılarak manuel veya dijital olarak sayılır. Birçok preklinik ve erken faz farmakolojik çalışmalar SCD28klinik etkinliğini tahmin edebilmek için ikincil bir sonuç değişkeni oluşturmak için hasta lık tsay kullanın,29,30,31 ,32. Ancak, zaman alıcı, değişkenlik yüksek ve duyarlılık düşük, teknik otomatik değildir ve bu nedenle, emek yoğun. Ayrıca, hastalık nedeniyle morfolojik değişiklikler, 2 boyutlu statik bir analiz2olduğu için, RBC deformite gibi fizyolojik parametreleri ile iyi ilişkili olmayabilir.
Oksijen gradyan ektasittometri hızlı ve tekrarlanabilir hastalık fonksiyonel bir töz sağlar. Bu endotel yüzeyi dikkate almaz bir in vitro testtir. Ancak, orak hücre çalışmaları için umut verici bir teknik yapma, hasta davranışı ve RBC özellikleri fonksiyonel yönlerini sağlar. Tekniğin gelecekteki uygulamaları arasında SCD hastalarında tedavi etkinliğinin izlenmesi, yeni tedavi stratejileri için biyomarker görevi gören, hastalık davranışının incelenmesi ve SCD’de kök hücre nakli sonrası kimerizmin izlenmesi yer almaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Eurostars hibe estar18105 ve RR Mekatronik tarafından sağlanan sınırsız bir hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar teknik destek için Sisto Hendriks ve Jan de Zoeten teşekkür ederiz.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |