Aqui, apresentamos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método rápido e reproduzível para medir a deformabilidade das células vermelhas do sangue em amostras de pacientes com doença falciforme desoxigenação controlada e reoxigenação. Esta técnica fornece uma maneira de estudar a noigestação de células vermelhas do sangue e monitorar a eficácia do tratamento da doença falciforme.
Na doença falciforme (SCD), uma mutação de ponto único na codificação de genes para beta-globina causa a produção de hemoglobina anormal S (HbS). Quando desoxigenado, hbs pode polimerizar, formando hastes rígidas de hemoglobina, resultando na noigização de glóbulos vermelhos (RBCs). Estes RBCs sickled reduziram significativamente a deformabilidade, causando vaso-oclusão, que conduz às complicações clínicas SCD-relacionadas numerosas, incluindo a dor, o curso, e dano do órgão. A deformabilidade da RBC também é reduzida pela desidratação da RBC, resultando em células vermelhas densas do sangue que são mais propensas a ser ceimais. Até à data, não há um único ensaio laboratorial amplamente disponível, rápido e reprodutível capaz de prever a gravidade da doença ou monitorar diretamente os efeitos do tratamento para terapias novas e não fetais de hemoglobina. Neste estudo, descrevemos um protocolo para medir a deformabilidade da RBC em função do pO2 que permite a quantidade de comportamento de doente em pacientes com DSD. A ektacytometria de gradiente de oxigênio mede a deformabilidade da RBC, expressa como o índice de alongamento (IE), em função do pO2. Rbcs são expostos a um estresse fixo cisalhamento de 30 Pa durante uma rodada de desoxigenação e reoxigenação. Seis parâmetros de leitura são produzidos. Destes, o ponto de engenamento (PoS), definido como o pO2 em que o EI máximo (EImax)mostra uma diminuição de 5%, e ei mínimo durante a desoxigenação (EImin)são os mais informativos, refletindo o pO2 de um paciente individual em que início de enomental e a deformabilidade mínima dos glóbulos vermelhos de um paciente, respectivamente. O PoS está associado à afinidade de hemoglobina de um paciente individual por oxigênio, enquanto o EImin mostra uma forte correlação com os níveis de hemoglobina fetal. Concluímos que a ektacytometria de gradiente de oxigênio é uma técnica promissora para monitorar o tratamento de pacientes com SCD, como um biomarcador para agentes anti-emifiqueimento em ensaios clínicos e pré-clínicos, e uma ferramenta importante para estudar o comportamento de enominagem de RBCs de indivíduos com SCD e traços falciformes.
Em SCD, uma mutação de ponto único resulta na produção de HbS, que pode polimerizar após a desoxigenação. A polimerização do HbS causa a noi da enoização dos RBCs e reduz a deformabilidade da RBC. A combinação de adesão à adesão à Adesão à Adesão ao endotelio da RBC leva a várias complicações do SCD, incluindo crises vaso-oclusivas (VOC), acidente vascular cerebral, danos nos órgãos e anemia hemolítica crônica. Mesmo em condições normoxic, a deformabilidade de RBC é comprometida nos pacientes com SCD. A deformabilidade é ainda mais diminuída em baixas concentrações de oxigênio. Os principais intervenientes que determinam a deformabilidade na normoxia são células densas, células irreversivelmente doentes (ISC) e células desidratadas, todas com uma diminuição da relação superfície-volume1,2,3.
A ektactometria é um método estabelecido para medir a deformabilidade da RBC, amplamente utilizada para o diagnóstico de anemias hemolíticas hereditárias, particularmente membranopatias4. Ele também pode ser usado para estudar hemorheologia5,6,7,8,9. A ektacytometria de gradiente osmótico, na qual a deformabilidade da RBC é medida durante uma mudança contínua na osmolalidade, tem sido usada para estudar SCD por mais de uma década10,11. A porcentagem de hemoglobina fetal (HbF) é um dos inibidores mais fortes da polimerização do HbS porque nem o HbF nem seu tetramer híbrido misto (2βSγ) podem entrar na fase12do polímero deoxyHbS. Estudos recentes sugerem que o aumento dos níveis de HbF em pacientes com SCD leva a uma melhor relação superfície-volume, melhorando assim o estado de hidratação e, portanto, a deformabilidade em pacientes não transfundidos11.
A deformabilidade da RBC tem sido estudada no passado como um biomarcador para complicações de SCD, mas com resultados conflitantes. Em estudos realizados transversalmente e em estado estável, indivíduos com níveis mais elevados de deformabilidade da RBC apresentaram maior incidência de osteoneconese e mais crises de dor13,14,15. Em contraste com esses achados, quando comparados aos valores estávels do Estado durante um VOC agudo, a deformabilidade da RBC foi diminuída em estudos longitudinais dentro dos mesmos indivíduos16. Essa discrepância pode ser o resultado do estudo da deformabilidade da RBC em diferentes condições (ou seja, durante o estado estável versus O VOC). A porcentagem de células doentes é alta no início de um VOC e as células são rapidamente destruídas à medida que a crise progride, o que pode explicar a diferença entre os dados de incidência transversal estável do estado e dados longitudinais obtidos durante o VOC. No entanto, outros fatores, como a adesão das subpopulações da RBC à superfície endotelial, também podem ser importantes na ocorrência de TA. Em SCD, é mais clinicamente relevante medir a deformabilidade durante a desoxigenação, pois vaso-oclusão geralmente ocorre nos venules postcapilares hipóxicos e não na rede microcapilar menos hipóxica17. Além disso, a presença de ISCs pode alterar a capacidade de um ektacytometer para medir a deformabilidade na normoxia. A distorção do padrão de difração é causada por ISCs, que resulta do não alinhamento durante o fluxo1,2,3.
Abordagens alternativas para estudar a fisiopatologia do VOC incluem medições da adesão da RBC a uma superfície artificial18,microtometria de microfluxo elétrico de impedância de célulaúnica19,modelos baseados em microfluídicos combinando quantitativa medições da célula falciforme e dessaudade com reologia celular única20,e polimerização induzida por laser21. Embora promissoras, essas técnicas são caras, trabalhosas e exigem treinamento extensivo do operador. Além disso, os ensaios que são baseados em morfologia não têm a capacidade de estudar o comportamento celular, como a deformabilidade, em função de um gradiente de oxigênio.
Neste estudo, descrevemos um ensaio funcional rápido e reproduzível realizado com um ektacytometer. Trata-se de uma medida de ektacytometria de próxima geração que mede os diferentes aspectos qualitativos da deformabilidade da RBC expressos como EI durante a desoxigenação (1.300 s) e reoxigenação rápida (280 s). Esses intervalos de tempo permitem a formação de polímeros HbS e, assim, a ocorrência de alterações morfológicas e, em seguida, a recuperação. A desoxigenação ocorre apartir da introdução de gás nitrogênio, o que diminui lentamente a tensão de oxigênio na amostra de sangue na lacuna entre o bob e o copo do ektacytometer. A deformabilidade da RBC é continuamente medida, enquanto a tensão de oxigênio é medida a cada 20 s por meio de um pequeno ponto O2presente na parede do copo. Durante o teste, aproximadamente 80 medidas de pO2 são acopladas ao EI medido naquele momento. A pressão de oxigênio cai abaixo de 20 mmHg durante a desoxigenação, e a reoxigenação é facilitada pela difusão passiva do ar ambiente. A configuração experimental do módulo ektacytometer e de ektacytometry de oxigênio é descrita na Figura 1 e na Figura 2. O princípio da ektacytometria é baseado na dispersão induzida pela RBC da luz de um feixe de laser. Isso resulta em um padrão de difração elíptica quando o estresse da cisalhamento é aplicado ao mesmo tempo(Figura 1).
Aqui descrevemos a ektacytometria de gradiente de oxigênio, um método que pode ser usado para estudar o comportamento falciforme dos glóbulos vermelhos de pacientes com SCD uma variedade de concentrações de oxigênio (Figura 4 e Figura 5). Para obter resultados reproduzíveis, é importante identificar os fatores que influenciam os resultados. Por exemplo, a temperatura tem um grande impacto na deformabilidade da RBC, principalmente devido aos seus efeitos sobre a espessura da solução viscosa (PVP). Recomendamos a realização de uma medição de teste no início do dia para aquecer completamente a máquina a 37 °C. Isso melhorará a reprodutibilidade dos resultados. A osmolaridade da solução viscosa deve estar dentro de uma faixa estreita (282-286 mOsm/kg para PVP), pois a osmolaridade influencia o status de hidratação, o que, por sua vez, afeta a deformabilidade da RBC. O pH e a viscosidade do PVP também devem ser rigorosamente regulamentados. Diferenças no pH e temperatura podem influenciar curvas dramaticamente22. Além disso, a água restante no copo, bob, e tubos, pode causar a linse de RBCs, resultando em dados incorretos, porque rbcs menos intactos presentes no copo será medido.
As configurações para realizar a ektacytometria de gradiente de oxigênio podem ser ajustadas para responder a questões de investigação específicas. As configurações preferidas estão listadas na Tabela 1. Um tempo de desoxigenação de 1.300 s foi escolhido com base em observações mostrando que a extensão da desoxigenação não resultou em um menorEI min para a maioria dos pacientes. Em contraste, o encurtamento do tempo de desoxigenação dificultaria o poder discriminativo da ektacytometria de gradiente de oxigênio. O tempo de reoxigenação foi fixado para 280 s devido aos polímeros HbS rapidamente resolutivos durante a reoxigenação, e restauração concomitante da IE para valores medidos antes da desoxigenação. O estresse da cisalhamento foi definido como 30 Pa, o que é análogo à ektacytometria de gradiente osmótico. A redução deste parâmetro pode dificultar o poder discriminativo. O controle de desoxigenação pode ser usado se um conjunto de velocidade de desoxigenação for aplicado a cada amostra do paciente. Em nossas configurações preferidas, essa opção foi desligada porque a taxa de desoxigenação é específica do paciente devido à curva única de dissociação de hemoglobina. Assim, ligar o controle de desoxigenação eliminaria essa característica do ensaio. No entanto, esta característica da ektacytometria de gradiente de oxigênio ainda está investigação.
Vários fatores bem conhecidos influenciam parâmetros de ektacytometria de gradiente de oxigênio, ou seja, pH, temperatura e osmolaridade. Ektacytometry, especialmente PoS, é influenciado por 2,3-difosofadeglicetria (2,3-DPG)22. Além disso, há uma clara correlação entre o %HbF e o EImin,e em menor medida PoS (Figura 5A–D). EImax está associado com as células falciformes na normoxia, o que pode explicar a observação de que logo após um VOC, rbc deformabilidade na normoxia (EImax),é maior. Este último é causado pela destruição das células mais doentes e, portanto, RBCs menos deformáveis durante o VOC16. Como mostrado na Figura 5F, RBCs mais ricos em % (definidos como RBCs com uma concentração de hemoglobina >1.11 mg/mL) correlacionam-se fortemente com ummáximode EI mais baixo. Isso indica que as células densas são um fator importante na deformabilidade da RBC na normoxia, semelhante aos resultados relatados anteriormente1.
A padronização das amostras é muito importante para a obtenção de resultados reproduzíveis e para a distinção entre diferentes genótipos e tratamentos. A correção para a contagem de RBC é importante, pois o número de RBCs influencia a intensidade do padrão de difração. Se os números mais baixos de RBC estão atuais na abertura entre o bob e o copo, a curva deslocará para cima e à esquerda. Além disso, a curva flutuará, dificultando o cálculo preciso dos parâmetros, especialmente o PoS.
Uma limitação desta técnica é que o valor do EI representa uma média de todas as células, incluindo subpopulações diferentes. A heterogeneidade das populações de LIN em pacientes com DST e sua influência na medição da ektacytometria têm sido intensamente estudadas. Isso resultou em padronização em que o tamanho do padrão de difração é ajustado a um valor fixo em vez de corrigido para a contagem RBC23,24. Se essa forma de padronização também deve ser aplicada ou não às medições de ektacytometria de gradiente de oxigênio está atualmente em estudo.
Várias técnicas para medir a deformabilidade da RBC em condições hipóxicos foram desenvolvidas com base em uma etapa de desoxigenação que ocorreu fora do ektacytometer25,26,27. Nessas condições, diferenças no comportamento celular não foram observadas entre pacientes com traços de HbS e controles saudáveis pH fisiológico25. Ektacytometry do gradiente do oxigênio, entretanto, mostra claramente um PoS baixo mas evidente nos indivíduos com traços de HbS (figura 4A). Até o momento, na prática clínica de rotina, os únicos métodos alternativos para medir a tendência dos RBCs de um paciente individual para a foice in vitro incluem um ensaio de eroto à base de morfologia: OS RBCs são incubados em condições que promovem a polimerização do HbS, baixa tensão de oxigênio ou baixo pH. Um fixador é adicionado após a incubação e a porcentagem de células doentes é contada manual ou digitalmente usando microscopia de luz. Muitos ensaios farmacológicos pré-clínicos e de fase inicial usam o ensaio de doie para gerar uma variável de desfecho secundário para ser capaz de prever a eficácia clínica em SCD28,29,30,31 32de pessoas. No entanto, é demorado, a variabilidade é alta e a sensibilidade é baixa, a técnica não é automatizada e, portanto, trabalhosa. Além disso, as alterações morfológicas devido à noidura podem não se correlacionar bem com parâmetros fisiológicos, como a deformabilidade da RBC, pois é um ensaio estática de 2 dimensões2.
A ektacytometria do gradiente do oxigênio fornece um ensaio funcional do sickling que é rápido e reproducible. Este é um teste in vitro que não considera a superfície endotelial. No entanto, ele fornece aspectos funcionais do comportamento falciforme e características RBC, tornando-se uma técnica promissora para estudos de células falciformes. Futuras aplicações da técnica incluem monitoramento da eficácia do tratamento em pacientes com SCD, atuando como biomarcador para novas estratégias de tratamento, estudo do comportamento de noie, e monitoramento do quimerismo após o transplante de células-tronco em SCD.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção Eurostars estar18105 e por uma subvenção irrestrita fornecida pela RR Mechatronics. Os autores agradecem a Sisto Hendriks e Jan de Zoeten por seu apoio técnico.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |