Isolement et différenciation des myoblastes primaires des explantations de muscle squelettique de souris
Summary
Les myoblastes sont des cellules précurseurs proliférantes qui se différencient pour former des myotubes polynucléés et éventuellement des myofibres musculaires squelettiques. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement efficace et la culture des myoblastes primaires des muscles squelettiques de souris jeunes adultes. La méthode permet des études moléculaires, génétiques et métaboliques des cellules musculaires en culture.
Abstract
Les myoblastes primaires sont des précurseurs proliférants indifférenciés du muscle squelettique. Ils peuvent être cultivés et étudiés comme précurseurs musculaires ou induits à se différencier en stades ultérieurs du développement musculaire. Le protocole fourni ici décrit une méthode robuste pour l’isolement et la culture d’une population fortement proliférante des cellules de myoblast des explants de muscle squelettique de souris de jeune adulte. Ces cellules sont utiles pour l’étude des propriétés métaboliques du muscle squelettique de différents modèles de souris, ainsi que dans d’autres applications en aval telles que la transfection avec l’ADN exogène ou la transduction avec des vecteurs d’expression virale. Le niveau de différenciation et le profil métabolique de ces cellules dépend de la durée d’exposition, et la composition des médias utilisés pour induire la différenciation du myoblaste. Ces méthodes fournissent un système robuste pour l’étude du métabolisme des cellules musculaires de la souris ex vivo. Fait important, contrairement aux modèles in vivo, les méthodes décrites ici fournissent une population cellulaire qui peut être élargie et étudiée avec des niveaux élevés de reproductibilité.
Introduction
Bien que souvent cité comme une indication de la santé métabolique globale, de multiples études ont montré que l’indice de masse corporelle (IMC) chez les personnes âgées n’est pas systématiquement associée à un risque plus élevé de mortalité. À ce jour, le seul facteur démontré compatible avec la réduction de la mortalité dans cette population est l’augmentation de la masse musculaire1. Le tissu musculaire représente l’une des plus grandes sources de cellules sensibles à l’insuline dans le corps, et est donc critique dans le maintien de l’homéostasie métabolique globale2. L’activation du tissu musculaire squelettique par l’exercice est associée à des augmentations de la sensibilité locale à l’insuline et de la santé métabolique globale3. Alors que les modèles in vivo sont essentiels pour étudier la physiologie musculaire et l’impact de la fonction musculaire sur le métabolisme intégré, les cultures primaires des myotubes fournissent un système tractable qui réduit la complexité des études animales.
Les myoblastes dérivés des muscles postnatals peuvent être utilisés pour étudier l’impact de nombreux traitements et conditions de croissance d’une manière hautement reproductible. Cela a longtemps été reconnu et plusieurs méthodes pour l’isolement et la culture du myoblaste ont été décrits4,5,6,7,8,9. Certaines de ces méthodes utilisent des muscles néonatals et produisent un nombre relativement faible de myoblastes5,8, nécessitant plusieurs animaux pour des études à plus grande échelle. En outre, les méthodes les plus largement utilisées pour cultiver les myoblastes utilisent le « pré-plaquage » pour enrichir les myoblastes, qui sont moins adhérents que les autres types de cellules. Nous avons trouvé la méthode alternative d’enrichissement décrite ici comme étant beaucoup plus efficace et reproductible pour enrichir une population de myoblastes hautement proliférante. En résumé, ce protocole permet l’isolement des myoblastes hautement proliférants des explants musculaires de jeunes adultes, par l’intermédiaire de la croissance dans les médias culturels. Les myoblastes peuvent être récoltés à plusieurs reprises, sur plusieurs jours, rapidement élargis, et induits à se différencier en myotubes. Ce protocole génère reproductiblement un grand nombre de cellules de myoblaste saines qui se différencient solidement en myotubes secousses spontanément. Il nous a permis d’étudier le métabolisme et les rythmes circadiens dans les myotubes primaires des souris d’une variété de génotypes. Enfin, nous incluons des méthodes pour préparer les myotubes pour l’étude du métabolisme oxydatif, en utilisant des mesures des taux de consommation d’oxygène dans les plaques de 96 puits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le muscle squelettique est essentiel pour l’établissement et le maintien de l’homéostasie métabolique11. L’étude de la physiologie musculaire est compliquée par la variabilité interindividuelle, ainsi que par la difficulté d’obtenir des échantillons, en particulier dans le cas des études humaines. Les myotubes primaires cultivés ont été montrés pour récapituler beaucoup de dispositifs de la physiologie de muscle, y compris l’homéostasie de calcium12,régéné…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Matthew Watt de l’Université de Melbourne et au Dr Anastasia Kralli de l’Université Johns Hopkins pour leur aide à adopter ce protocole basé sur les travaux de Mokbel et al.,6. Nous remercions également la Dre Sabine Jordan pour son aide à l’élaboration et à l’adoption de ce protocole dans notre laboratoire. Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health R01s DK097164 et DK112927 à K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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