Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants
Summary
Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.
Abstract
Primäre Myoblasten sind undifferenzierte proliferierende Vorläufer des Skelettmuskels. Sie können kultiviert und als Muskelvorläufer untersucht werden oder induziert, um in späteren Stadien der Muskelentwicklung zu unterscheiden. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Isolierung und Kultur einer stark proliferativen Population von Myoblastzellen aus jungen erwachsenen Mausskelettmuskelexplantationen. Diese Zellen sind nützlich für die Untersuchung der metabolischen Eigenschaften des Skelettmuskels verschiedener Mausmodelle sowie in anderen nachgelagerten Anwendungen wie Transfektion mit exogener DNA oder Transduktion mit viralen Expressionsvektoren. Der Grad der Differenzierung und des metabolischen Profils dieser Zellen hängt von der Dauer der Exposition und der Zusammensetzung der Medien ab, die zur Induzieren von Myoblastendifferenzierung verwendet werden. Diese Methoden bieten ein robustes System für die Untersuchung des Stoffwechsels von Mausmuskelzellen ex vivo. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Methoden im Gegensatz zu in vivo-Modellen eine Zellpopulation bieten, die mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden kann.
Introduction
Obwohl oft als Hinweis auf die allgemeine metabolische Gesundheit genannt, haben mehrere Studien gezeigt, dass der Body-Mass-Index (BMI) bei älteren Erwachsenen nicht konsequent mit einem höheren Sterblichkeitsrisiko verbunden ist. Bis heute ist der einzige Faktor, der mit der reduzierten Sterblichkeit in dieser Population konsistent ist, erhöhte Muskelmasse1. Muskelgewebe stellt eine der größten Quellen von Insulin-empfindlichen Zellen im Körper dar und ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der gesamten metabolischen Homöostase2. Aktivierung des Skelettmuskelgewebes durch Übung ist verbunden mit Erhöhungen der lokalen Insulinempfindlichkeit und der allgemeinen metabolischen Gesundheit3. Während In-vivo-Modelle für das Studium der Muskelphysiologie und die Auswirkungen der Muskelfunktion auf den integrierten Stoffwechsel unerlässlich sind, bieten Primärkulturen von Myotuben ein beschreibbares System, das die Komplexität von Tierstudien reduziert.
Myoblaste, die aus postnatalen Muskeln gewonnen werden, können verwendet werden, um die Auswirkungen zahlreicher Behandlungs- und Wachstumsbedingungen in einer sehr reproduzierbaren Weise zu untersuchen. Dies ist seit langem anerkannt und mehrere Methoden für myoblast Isolation und Kultur wurden beschrieben4,5,6,7,8,9. Einige dieser Methoden verwenden neonatale Muskeln und ergeben relativ geringe Anzahl von Myoblasten5,8, erfordert mehrere Tiere für größere Studien. Auch die am häufigsten verwendeten Methoden zur Kultivierung von Myoblasten verwenden “Pre-Plating”, um myoblasts zu bereichern, die weniger haftend sind als andere Zelltypen. Wir haben festgestellt, dass die hier beschriebene alternative Anreicherungsmethode viel effizienter und reproduzierbarer für die Anreicherung einer hochproliferativen Myoblastpopulation ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Isolierung von hochproliferativen Myoblasten von jungen erwachsenen Muskelexplantationen über das Auswachsen in Kulturmedien ermöglicht. Myoblaste können wiederholt geerntet werden, über mehrere Tage, schnell erweitert, und induziert, in Myotubes zu differenzieren. Dieses Protokoll erzeugt reproduzierbar eine große Anzahl gesunder Myoblastzellen, die sich robust in spontan zuckende Myotuben differenzieren. Es hat uns ermöglicht, Stoffwechsel und zirkadiane Rhythmen in primären Myotuben von Mäusen einer Vielzahl von Genotypen zu studieren. Schließlich schließen wir Methoden zur Vorbereitung von Myoröhren für die Untersuchung des oxidativen Stoffwechsels ein, indem wir Messungen der Sauerstoffverbrauchsraten in 96-Well-Platten verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skelettmuskel ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase11. Die Untersuchung der Muskelphysiologie wird durch interindividuelle Variabilität sowie Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Proben, insbesondere bei Studien am Menschen, erschwert. Kultivierte primäre Myotuben haben gezeigt, dass viele Merkmale der Muskelphysiologie zu rekapitulieren, einschließlich Kalziumhomöostase12, Regeneration von geschädigtem Muskelgewebe<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Matthew Watt von der University of Melbourne und Dr. Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University für die Unterstützung bei der Annahme dieses Protokolls auf der Grundlage der Arbeit von Mokbel et al.6. Wir danken auch Dr. Sabine Jordan für die Unterstützung bei der Entwicklung und Annahme dieses Protokolls in unserem Labor. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01s DK097164 und DK112927 an K.A.L. finanziert.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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